摘要：文章介绍高等植物H+-PPase 的属性、功能及其分子生物学的研究进展，并着重阐述H+-PPase对逆境的反应以及在植物抵御盐及干旱胁迫中的作用。
关键字：H+-PPase；属性；功能：逆境；干旱胁迫；进展
H+转运无机焦磷酸酶(H+-pyrophosphatase，H+-PPase)是一种区别于H+-ATPase的H+转运酶，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中。在液泡膜上，H+-PPase能够把无机焦磷酸(PPi)大民3307
水解产生的自由能和H+跨膜转运相藕联，在将PPi水解为2个Pi的同时，还将细胞质中的H+经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，与液泡膜H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力。最适pH为7.5~8.5，该酶的结合底物是Mg2PPi，可被K+等阳离子激活，而对阴离子不敏感，但被F-抑制。自 1975年Karlsson从甜菜 (Beta vulgaris)根中分离到钾激活的H+-PPase以来，近几十年，此酶的研究已经取得了长足的进展，并对其生理生化性质逐步达成共识。随着分子生物学研究的不断深入，人们已经成功地从拟南芥、 大麦、甜菜、烟草、水稻、绿豆等众多生物体中分离到 H+-PPase 的cDNA。此酶的结构和特性，特别是它在植物耐盐抗早中的作用和调节植物生长方面的功能己经逐渐成为众多研究者关注的焦点，近年来，通过克隆并转化 H+-PPase 基因以提高植物耐盐性和抗旱性的基因工程已经展开，现将这方面的研究进展介绍如下。
1. H+-PPase的属性
1.1 Vmax和Km
Davies等计算出 1mol PPi在细胞质中（pH = 7.3)水解会产生27.3 kJ 的自由能。Maeshima发现H+-PPase的H+/PPi化学当量为1。H+- PPase在液泡膜中的比活性(specific activity)随不同植物种类、不同组织以及不同的测定方法而出现差异。在绿豆幼苗下胚轴、红甜菜根、拟南芥叶片、南瓜幼苗子叶、海藻以及 CAM植物等生物体中，人们检测到的H+-PPase标准比活性值分别为 1.10 、0.30 、0.52 、0.35 、1.56 和 0.22~0.71μmol (PPi) · min-1 ·mg-1 (membrane protein)。但从这些生物体内纯化出的H+-PPase蛋白的比活性都高于它们的标准值，光合细菌中纯化出的H+-PPase的比活性甚至达到了20 μmol · min-1· mg- 1。酶动力学(enzyme kinetics)分析表明，H+-PPase的Km值在不同物种间差异很大，在植物细胞中，酶促反应达到最大速度 (Vmax)时所需的底物(PPi)浓度最高约为200 μmol·L-1。
1.2 辅助因子
大量的研究发现，H+-PPase 的底物实际上是 Mg2+ 和 PPi 所形成的一种络合物(Mg2PPi)。同时，游离 Mg2+ 是 H+-PPase 的一个基本的辅助因子，与酶结合后，在保持酶的活性和稳定性中发挥着重要的作用。目前，人们对于H+-PPase 上Mg2+ 结合位点的确切数量还不清楚。但是， Baykov 等发现，在绿豆 H+-PPase上存在两个 Mg2+ 结合位点，即高亲和性结合位点(Km= 23 ~ 31 μmol·L-1 ) 和低亲和性结合位点(Km= 0.25 ~ 0.46 μmol·L-1 )，并由此推测，单个H+-PPase 分子上可能至少存在两个不同的 Mg2+ 结合位点。Yazaki 等检测到，当细胞质中游离 Mg2+ 达到 0.4 mmol·L-1 时，H+-PPase 能表达出不低于90%的活性。 Mg2+ 与金花瓶1999H+-PPase结合对该酶不仅有活化作用，还有保护作用，使其在较高温度下不易失活。
除受Mg2+激活外，H+-PPase 还可能受 K+ 和NH4+等激活。Davies 等通过膜片钳技术发现，K+对红甜菜贮根中的 H+-PPase具有矢量激活效应，这种激活作用只发生在液泡膜的细胞质侧。Pugliarella 等发现萝卜 (Raphanus sativus) H+-PPase 活性尤其是H+ 转运活性表现出对 K+ 的绝对需要，这己从随后的很多研究中得到证实。研究表明，K+ 的刺激能使 H+-PPase 的活性增大3倍以上，其Km 值在不同植物中表现不一，低至4 mmol·L-1以下，高至60 mmol·L-1以上。一般情况下，当KCl 的浓度达到30 mmol·L-1左右时，酶活性就能达到最大值，但蚕豆(Vicia faba )保卫细胞H+-PPase的活性只有在较高的K+浓度(Km = 51 mmol·L-1 )下才能达到最大。有些研究还发现，与 KCl相比 K2SO4对 H+-PPase的激活效果更好。一些竞争性抑制剂能够抑制 K+对 H+-PPase的激活作用，Gordon-weeks 等报道，K+对H+-PPase的激活作用能够被Tris(浓度在 25 mmol·L世界上最低的盆地-1以上)所抑制，当K+浓度低于10 mmol·L-1 时，抑制作用更为强烈，目前，人们对这种竞争性抑制的生化机制仍不清楚。
有趣的是，Drozdowicz 等发现了拟南芥的另外一种H+-PPase基因AVP2，AVP2和AVP1一样，也可以被Mg2+激活，但与 AVP1不同的是，它对K+等一价阳离子并不敏感，却对Ca2
sh8298u+ 敏感;比较AVP2与AVP1的氨基酸序列，发现它们的同源性只有36%。因此，Drozdowicz 等 、Belogurov 和 Lahti 认为，同一个有机体中的H+-PPase可以分为两个类型，即I型(AVP1 类)和II型(AVP2 类);他们分析拟南芥和其它有机体中的H+-PPase系统的结果进一步表明，II型H+-PPase并不是I型H+-PPase的同功酶，而是存在于植物(甚至一些真核生物和原核生物)体内的另外一类H+-PPase;在同一个有机体内，I型和II型H+-PPase共存于液泡膜上，但可能定位于液泡膜的不同区域，调节细胞的不同生理过程。
2. H+-PPase的分子结构
2.1 H+-PPase的克隆
Lahti 吉西他滨等(1988) 以大肠杆菌为材料，通过克隆的方法得到不完全的PPase的碱基核苷酸序列。Sarafian 等( 1992 )筛选了拟南芥的表达文库，第一次筛选出H+-PPase 的cDNA全长核苷酸组成，并命名为AVP1(M81892)。随后，不同的人运用不同的方法，从不同的植物中得到了结构和功能相似的H+-PPase的基因全长。 Nakanishi 和Maeshima (1999a) 比较11不同植物物种的 H+-PPase 蛋白的多肽序列，从而得出相似性为86％到91％之间。
通过前期研究资料的积累，Nakanishi (2001)根据绿豆液泡膜无机焦磷酸酶分子结构特点，提出H+-PPase 在生物体内形态结构模型（图2-1）。
图 2-1 H+-PPase 的拓扑结构模式图(Maeshima, 2000)
Fig 2-1 The structure map of H+-PPase by TMpred program
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在此模型中，液泡膜H+-PPase 被分成14个区域，他们横跨液泡膜的内外，在这14个区域中，又把他们分为氨基酸残基变化不怎么大的在结构和功能上保守的3个区域(CS1,CS2, CS3)，不同的保守域有不同的生理生化功能：保守域CS1使底物发生水解，其主要存在于 液泡膜外侧，多肽序列DVGADLVGKVE是酶结合并使底物水解的部位，故此保守域是酶行使催化能力的关键部位。不同的物种该保守部位氨基酸残基序列也不一样，在伞藻属（Acetabularia）中，处于第三位氨基酸残基为Ala残基(Ikeda and Rahman1999)；而在拟南芥中，第十位的氨基酸残基为Ile残基。保守域CS2是位于亲水环上的一个保守域，保守域CS3是位于该酶氨基酸残基的C端，位于CS3上面的氨基酸残基通常随着物种不同而不同。在绿豆中，CS3保守域氨基酸残基的C端三个谷氨酸残基在功能上起到很大作用，其不能被另外任何一个氨基酸残基替代，否则就会导致该酶失活(Nakanishi 1999b)。根据上述结果，学者猜想CS3可能位于液泡膜的外侧，与另外两个保守域一起在发挥该酶的催化功能，单独的保守域不具备全酶的催化活性，当三个保守域相互作用，酶才表现出催化能力(Maeshima M 2000)。H+-PPase位于细胞内的位置，不同的学者研究不同的材料得出不同的结果。从研究的结果上看，H+-PPase在很多植物中定位于液泡膜上是比较多(Baykov 1993)。但也在细胞膜上面检测到过H+-PPase的活性，Long等(1995)以萌发蓖麻(Ricinus communis)种子的子叶为材料，通过检测细胞质膜、幼苗的子叶和根部的维管束筛孔细胞质膜上的H+-PPase活性，结果发现，上述部位都有H+-PPase活性的存在。 Robinson等(1996)通过免疫反应的方法，在豌豆子叶质膜上在发现有H+-PPase的存在，分子量测量发
现其为73 kD，但与液泡膜上H+-PPase不同的是，位于豌豆子叶质膜上的H+-PPase 活性比较低，后者只为前者的 25% ；随后，在衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 质膜碎片中也发现了 H+-PPase 蛋白，并具有催化活性（Robinson 1998）。但由于衣藻特殊的结构和运动状态，导致收缩泡膜能与质膜发生膜融合，使位于不同膜上面的蛋白发生交换，也使位于缩泡膜上的H+-PPase转移到质膜上，使衣藻质膜上具有H+-PPase活性（Robinson 1998）。目前，关于不同物种的质膜H+-PPase在生理生化方面所起到的作用以及它们如何定位到质膜上这一生理过程了解的还比较少。
图 2-2 拟南芥，西红柿，甜菜，大麦，水稻，南瓜的 H+-PPase 序列中高度保守片段的比对分析(Maeshima. 2000)
催化区域(下划线部分)可能在第一个保守片段(CS 1)中，相同的残基和保守的残基分别用“*”和“′”标出。
Fig 2-2 Analysis of H+-PPase high conservative domains by Blast in tobacco, beet, barley, rice, and pumpkin ( Maeshima. 2000)
activative domain maybe in the first conservative domain, “*” and “′” respectively delegate the same and conservative amino acid.
2001 年，Mitsuda 等(2001)研究了拟南芥中的 H+-PPase 在不同组织中的表达情况，同时对该酶所在细胞内的位置也进行了定位分析，发现在雄蕊的毛状体和花丝中AVP2/AVPLI 的表达量要远远高于拟南芥其他的组织和器官；同时，荧光定位也发现，融合绿荧光蛋白 GFP-AVP2/AVPL1 在细胞质中和高尔基体上，高尔基体上面融合蛋白的的含量较其他地方密集，这表明这种新型的 H+-PPase 可能定位于高尔基体膜上面。2005 年，Kuo 等(2005)通过黄化处理绿豆幼苗，分离出了质膜，液泡膜内质网膜等不同的膜，研究发现在内质网的膜制剂中有一种不同于以往发现的 H+-PPase，对液泡膜H+-PPase 激活活性有
抑制作用的抗体不能降低该酶的活性，这就说明了这种内质网上的H+-PPase 蛋白是不同于液泡膜上的 H+-PPase。但这些明显不同于前人研究的的 H+-PPase蛋白与 II 型 H+-PPase 是不是同功酶，它们之间的的同源性有多大，保守域是否一样，催还区域是否相同，现在学者们还了解的不是很多。H+-PPase 中起催化作用的位置，他们与底物结合到一块，同时该中心区域促进 PPi水解和 H+进出细胞内。能量在细胞内的转移也与该催化中心息息相关。关于该区域的组成，可能包括位于细胞质内测的三个保守区域和两个亲水环，在亲水环上有一些氨基酸残基是该酶发生功能所必需的，不能被另外的氨基酸残基所替代，三个保守区域和两个亲水环的片段通过空间上的接近或者结合到一起，使 H+-PPase 具有立体结构，立体结构的形成让 H+-PPase 具有了催化能力。目前，科学家们正在用更加先进的技术手段不断研究 H+-PPase 的立体结构，探讨不同保守域和亲水环之间的相互作用，揭示酶催化机理(包爱科 2006)。
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