浙江省男男性接触hiv-1感染者病毒基因特征分析

·论 著·
浙江省男男性接触HIV-1感染者病毒基因特征分析
姚亚萍,张佳峰,徐云,潘晓红,杨介者,郭志宏,夏燕,黄学敏
浙江省疾控预防控制中心,浙江杭州310051
摘要:目的 分析浙江省2004—2011年117名男男性接触者(MSM)HIV-1感染病毒的序列特征,了解HIV-1毒株类型和特征。方法 从实验室留样的MSMHIV感染者血液中提取DNA或RNA,用巢式PCR或RT-PCR方法扩增gag、pol基因区片段,测定序列并分析。结果 117名MSMHIV感染者中,序列结果按户籍来源覆盖21个省(市、自治区),感染毒株包括CRF01_AE99名(84 62%)、B亚型7名(5 98%)、CRF07_BC6名(
5 13%)、CRF08_BC和CRF59_01B各1名(0 85%)。3名(2 56%)疑似01_B重组毒株与安徽感染者在系统进化树上聚集成可靠的次级进化簇(99%),且具有类似重组断点模式。84个CRF01_AE毒株的pol区基因序列聚集成簇,形成多个可靠的次级进化簇(
30个节点的bootstrap值高于70%)。结论 浙江省MSMHIV感染者主要流行CRF
01_AE毒株,该人HIV感染率高,应加强监测。CRF59_01B和新的01B重组毒株在浙江首次检出。
关键词:HIV-1;男男性行为;基因特征
中图分类号:R521 91  文献标识码:A  文章编号:1007-0931(2014)09-0880-04
AnalysisonthegeneticcharacteristicsofHIV-1infectedMSMindividualsinZhejiangprovince
YAOYa-ping,ZHANGJia-feng,XUYun,PANXiao-hong,YANGJie-zhe,
GUOZhi-hong,XIAYan,HUANGXue-min
TheCenterforDiseaseControlandPreventionofZhejiangProvince,Hangzhou,Zhejiang,310051,China
Abstract:Objective Toanalyzethesubtypesandch
aracteristicsofHIV-1amongmenwhohavesexwithmen(MSM)inZhejiangprovincefromtheyear2004to2011.Methods BloodDNA/RNAwasextractedfromtheMSMHIV-1infectedindividualsandthenHIV-1gagandpolfragmentswereamplifiedbynestedpolymerasechainreaction(nested-PCR)orRT-PCR.ThepositivePCRproductsweresequencedandtheobtainedsequenceswereanalyzedbyphylogeneticinference.Results Atotalof117HIV-1infectedMSMindividualswereanalyzed,covering21provincesaccordingtotheirhouseholdregistry.Totally,threemajorstrainswereidentifiedincludingCRF01_AE(84 62%,n=99),B(5 98%,n=7)andCRF07_BC(5 13%,n=6) Moreover,3novel01Brecombinantstains,1CRF59_01Band1CRF08_BCwerefound.Accordingtotheneighbor-joiningtreebypolfragments,thereweremorethan30subclusterswithbootstrapvaluehigherthan70%amongthe84CR
F01_AEsequences.Conclusion CRF01_AEisthemajorHIV-1infectionstrainamongMSMinZhejiangprovince.CRF59_01Bandothernovel01BrecombinantstainsarefirstreportedamongMSMindividualsinZhejiangprovince.
Keywords:HIV-1strains;Menwhohavesexwithmen(MSM);Geneticcharacteristics
基金项目:浙江省医药卫生科技项目(2012KYB054,2013KYB059)作者简介:姚亚萍,硕士,副主任技师,主要从事艾滋病检测和后
勤管理工作
通讯作者:黄学敏,E-mail:xmhuang@cdc zj cn
  2013年1—10月浙江省新报告HIV/AIDS
3007例,性接触是艾滋病疫情传播的主要途径,
占95 9%。男男性接触人(Menwhohavesex
withmen,MSM)是艾滋病感染的高危体,占37 2%。监测显示,近几年浙江省MSM人HIV/AIDS感染率维持在8%左右,已成为艾滋病疫情快速增长的主要原因之一。
本研究对2004—2011年浙江省117名M
SMHIV-1感染者进行基因特征分析,了解浙江省
MSM人流行毒株的传播和遗传特征,对有效分析该人的毒株变异及动态变化,了解疫情流行趋势,实施有针对性的防控措施具有重要意义。
1材料与方法
1 1材料117名MSM感染者血清标本为实验室在2004—2011年采集并完成CD4细胞计数检测后的留样,流行病学基本信息来源于各级疾病预防控制中心流行病学调查,并输入国家疫情网络直报系统的个案报表。
1 2方法
1 2 1核酸提取及目的片段扩增gag区基因扩增:使用QIANGEN公司的QIAampBloodMiniKit对200μL全血样本进行基因组DNA的提取;以提取的DNA为模板,G
agF2和GagE2为外侧引物,C-gag和306为内侧引物,nest-PCR方法扩增HIVgagp17和p24交界区的650bp基因片段,扩增引物及反应条件见文献[1]。Pol区基因扩增:使用生物梅里埃公司的NUCLISISOLKITAUTOMATED试剂盒从200μL血浆样本提取HIVRNA;以提取的RNA为模板,RT-21为外侧反向引物,进行RT-PCR反应。以得到的cDNA为模板,MAW-26为外侧引物,PRO-1、RT-20为内侧引物,进行nest-PCR扩增pol基因区1300bp片段,涵盖蛋白酶(protease,PR)全部和部分逆转录酶(RT)基因。扩增引物和扩增条件见文献[2]。
1 2 2扩增片段鉴定和序列测定PCR扩增阳性片段经1%琼脂糖凝胶电泳与标准DNAmarker比较无误后由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。标准DNAmarker购于大连宝生物工程有限公司。
1 2 3序列分析使用NTIadvance9软件包组件contigexpress对序列进行编辑、拼接和校正。使用Bio-Edit软件的CLUSTALmultiplealignment对样本序列和分型参考毒株序列进行排列比对。用mega软件构建Neighbor-Joining系统进化树;用Simplot软件做断点分析。分型参考株序列来自HIVDatabases数据库(http://www.hiv.lanl.gov/)。其中2011ANHUI XC46、2011ANHUI MAS59、2011ANHUI WH73、2011ANHUI
HF115参考序列从安徽省MSMHIV感染者中检出[3]。
2结 果
2 1流行病学特征检测获得gag基因区序列35个、pol基因区序列95个,均来源于117名HlV感染者。117名MSMHIV感染者中:95 73%为汉族,71 79%未婚;年龄19~49岁占总数的96 58%,尤以19~29岁年龄组占多数(68 38%);文化程度相对较高,大专以上占34 19%,高中或中专占23 93%。60 68%(71人)为本省户籍,39 32%(46人)为外省户籍。外省户籍分布较广,涵盖20个省,以浙江周边的安徽(10人)、江西(5人)相对较高,占外省户籍总数的32 61%。其余各省均为零散病例,包括江苏、四川、山东和黑龙江各3人;云南、陕西、吉林、广西和河南各2人;贵州、重庆、广东、湖北、内蒙古、甘肃、河北、辽宁和西藏各1人。MSMHIV感染者现住址主要集中在杭州和宁波,见表1。
表1 浙江省MSM人中的117例HlV感染者地区分布
项目杭州湖州嘉兴金华宁波绍兴台州温州合计
例数7636317615117
构成比(%)64.962.565.232.5614.535.130.854.28100.
00
2 2亚型构成和基因距离分析117名MSMHlV感染者主要流行的毒株为CRF01_AE,占84 62%(99人),其次为B亚型5 98%(7人)和CRF07_BC5 13%(6人),也发现CRF59_01B、CRF08_BC和新的01B重组毒株,分别占0 85%(1人)、0 85%(1人)和2 56%(3人)。
对MSM人主要流行的CRF01_AE、B和CRF07_BC毒株进行基因距离分析。总体上,B亚型毒株序列遗传亲缘关系较远,组内基因距离最大(gag基因0 065±0 023,pol基因0 053±0 015);其次为CRF01_AE(gag基因0 037±0 013,pol基因0 035±0 009);CRF07_BC毒株具有较近的遗传关系,基因距离最小(gag基因0 028±0 008,pol基因0 008±0 006),见表2。solf
表2 浙江省MSM人HIV感染者主要流行
毒株基因距离分析
亚型或
流行重组型
gag区
序列数组内基因距离
pol区
序列数组内基因距离
B70.065±0.02330.053±0.015
效益最大化
CRF07_BC30.028±0.00830.008±0.006
CRF01_AE250.037±0.013840.035±0.0092 3系统进化分析对95名MSMHIV感染者的pol区序列做NJ进化分析:其中84个CRF01_AE
毒株与TH 90 CM240 U54771和CN 05 05GX001 GU564221国际参考株聚集成簇,该簇内有30个节点的bootstrap值高于70%。其他毒株分别与07-BC 97CN001、08-BC 97CN6F、B TH 90 BK、CRF59_01B国际参考株和安徽病例参考株聚集成簇,均具有较高bootstrap值。
2 4新的01_B重组毒株验证本研究检出3名新的01_B重组毒株,为1987—1989年出生的未婚男性,均于2011年确认感染HIV-1病毒。其中11ZJ4087病例为性病门诊检出,其余2人为自愿咨询门诊检出,见表3。
表3 3例01_B重组毒株感染者的基本信息
样品编号籍贯出生年月确认时间采样时间CD4计数
(cell/μL)
职业
11ZJ4087浙江1989.92011.4.12011.4.26448学生
11ZJ4530浙江1987.42011.3.242011.6.4397工人
11ZJ4516安徽1988.12011.3.182011.6.4608待业
  pol区序列NJ系统进化树分析显示:11ZJ4087、11ZJ4530和11ZJ4516病例与安徽病例(2011ANHUI XC46、2011ANHUI MAS59、2011A
NHUI WH73、2011ANHUI HF115)独立成簇,bootstrap值为99%,见图1,组内基因距离为0 024±0 010;与CRF52_01B参考株的基因距离为0 055±0 005;与CRF01_AE参考株的基因距离为0 066±0 007;与B亚型参考株的基因距离为0 087±0 003;与CRF15_01B的基因距离为0 082±0 006。
对11ZJ4087和2011ANHUI XC46pol区序列进行Simplot断点分析:序列以CRF01_AE为骨架,在700-950bp(HXB2核苷酸2857-3117)之间出现2个的重组断点,被B亚型相应基因片段替换,见图1。
关于厉行节约反对食品浪费的意见
根据上述分析,初步判定这3例可能为新的01_B重组毒株,且与安徽毒株有直接或间接的流行病学关系。该重组模式在浙江省MSMHIV感染者中首次检出。
3讨 论
浙江省2004年首次报告在MSM人中检出HIV感染者,到2012年底共报告3000多例,占全省累计报告病例数的26 3%,病例构成比上升明显。控制HIV在MSM人中的传播已经成为浙江省艾滋病防控重点之一。2008年浙江省增设MSM人监测哨点,当年报告该人HIV抗体阳性检出率为4 4%,近几年一直维持在8%左右。新发感染监测结果表明,MSM人新发感染率处于较高水平。疫情监测报告显示,浙江省MSM人HIV感染者平均年龄31岁;本省
户籍近60%;以未婚为主,占63 5%;高中以上学历占60%左右,以汉族人为主,占97 4%。本次研究MSM人HIV感染者平均年龄31 3岁;本省户籍60 68%;高中以上学历占58 12%;71 79%未婚;95 73%为汉族。研究样本与监测报告病例基
本特征接近,分析结果具有一定的代表性。
注:A为11ZJ4087;B为2011ANHUI XC46。背景序列选择:
01AE TH 90 CM240;B共享序列和D CD 83 ELI。
图1 新的01_B重组毒株的Simplot断点分析
本研究共分析117例MSMHIV感染者,感染CRF01_AE的占84 61%、B亚型占5 98%、CRF07_BC占5 13%;另外还检出3例新的01_B重组毒株、1例CRF08_BC和1例CRF59_01B。gag和pol区序列进化分析表明,MSM人传播的B亚型组内基因距离最大,其次为CRF01_AE和CRF07_BC。有文献报道,HIV-1毒株在某个地区或人的基因距离每年增加0 5%~1%。因此流行时间越长,基因距离越大[4]。据此估计,B亚型毒株最早传入浙江MSM人,然后是CRF01_AE和CRF07_BC。
本研究检出的MSMHIV感染者户籍覆盖全国20个省,但以安徽、江西省病例数相对较多,占外省户籍总数的32 61%(15/46)。2004—2009年的监测报告显示,浙江MSM人HIV感染者外省户籍以安徽省最多,占21 74%(10/46),其次为
四川省、河南省、江西省[5]。哨点监测中MSM人也以安徽籍占比例最多。从系统进化树分析,不同省份来源的MSM感染者与浙江本地户籍样本聚集成簇,CRF01_AE簇内有30个节
点bootstrap值高于70%,表明各病例之间存在直接或间接传播关系。因此,浙江省MSM人的HIV疫情活跃,传播密切,并且存在集中、快速发展趋势。
本研究有3名感染者感染新的01_B毒株,系统进化树上与安徽省样本聚集成簇,bootstrap值为99%,组内基因距离为0 024±0 010。这3个病例均通过男男性接触感染,均居住在杭州城西,其中1人是在校大学生。Simplot断点分析结果显示,浙江感染者序列与安徽序列pol区的重组断点模式类似。本研究的3名感染者与安徽省样本均为2011年检出,一方面,浙江省与安徽省的MSM人往来频繁,存在密切传播关系;另一方面,通过男男性接触途径,该疑似01_B重组毒株已经发生省际扩散,应警惕其成为MSM人的又一个优势毒株。
CRF59_01B是尚红团队在辽宁省MSM人检出的新的流行重组模式[6]。本研究有一个样本(HZ11ZJ4214)在系统进化树上与来自辽宁的3株CRF59_01B参考序列(KC462190,KC462191,JX960635)聚集成簇,bootstrap值为99%。流行病学调查资料显示,HZ11ZJ4214为杭州郊县户籍的一名25岁男性,2011年婚前体检时确认感染HIV-1,传播途径为同性性行为。虽然目前尚不清楚该毒株如何传播进入浙江省,但浙江省MSM人毒株类型更趋复杂已是不争的事实。
多性伴和无保护的肛交性行为使得MSM成为HIV/AIDS的高危人[7]。多个研究资料表
明[8-12],相对于其他传播途径,目前报告的MSM感染者大多居住在较为发达的中心城区,学历较高,年龄偏低,其中不乏在校大学生和生活层次较高的白领阶层。由于安全套使用率低,导致MSM人HIV感染风险居高不下[13-15]。部分省的个别地区MSM人HIV感染率高达20%[16]。除浴池桑拿等洗浴场所、酒吧会所等娱乐休闲场所、公园公厕等公共场所以及家等日常活动场所外,互联网(46 6%)已经成为MSM人寻性伴的另一种方式[9]。虽然男男性行为的产生有复杂的生物学和社会学背景,但是作为艾滋病传播的高危人,如何在这样一个特殊体中开展有效的宣传和干预工作,尽快遏制该人艾滋病快速传播的势头,是摆在我们面前的一个棘手难题。志谢 浙江省各市、县疾病预防控制中心相关人员对本研究的大力支持
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收稿日期:2014-02-20 修回日期:2014-06-06 本文编辑:吴陈军

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