感染性疾病一直是世界范围内一类主要致死性疾病[1]。世界卫生组织(WHO)监测统计数据显示，在2016年全球约5 690万例死亡患者中，有3种感染性疾病(下呼吸道感染、腹泻性疾病、结核)位列前十大死因，造成的死亡数约占总死亡数的10%，其中下呼吸道感染造成约300万例患者死亡，腹泻性疾病造成约140万例患者死亡，结核造成约130万例患者死亡[2]。感染性疾病的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，而在目前的临床微生物检测工作中，微生物实验室对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪开展的培养、染镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测(如PCR)、分子免疫学检查(如ELISA)等检测手段，存在着样本处理过程复杂、花费时间长、可检测病原体种类少等缺点，导致感染性疾病的病原学诊断、病情评估及方案制定等存在困难[3]。目前仍有约60%的感染性疾病的病原体是诊断不明的[4]。由于宏基因组测序对病原学诊断具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原学诊断之中。本文回顾了近些年宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的临床应用进展情况。 1 临床宏基因组学(Clinical metagenomics，CMg)
1.1 CMg的发展史
宏基因组的概念最早在1998年被学者提出，指在一份独立的土壤标本中，所有微生物的基因组信息的总
春天里 农民工和，包括那些无法培养的生物体的基因组信息[5]。后来，宏基因组的概念不仅仅局限于描述环境来源的标本，还被逐渐用于描述临床来源标本中的生物遗传信息特征。CMg指为获取临床相关的微生物信息而对临床来源的标本中所有的核酸序列进行测序分析的一门学科[6]。宏基因组测序主要是通过以新一代测序(Next-generation sequencing，NGS)或称二代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性及毒力等一系列生物信息[7]。
以Sanger测序为代表的一代测序技术一般仅可获取数百个碱基序列信息，由于其耗时且昂贵，正被后续发展的高通量测序所取代。现有的高通量测序技术可读取的核酸读长范围从数十碱基到数万碱基不等，其中二代测序技术一般具备短读长、高通量、准确率较高且花费较低等优点，三代测序虽然可直接读取较长核酸序列信息且速率更快，但是目前随机错误率更高，花费也更多[8]。通过评估临床应用中对检测结果所要求
的精确度、时间及花费等诸多因素，可有条件地从中选择合适的测序方式。
朗文交互英语由于宏基因组测序不依赖病原体培养结果且可以不对可疑病原体的标志核酸序列进行靶向扩增，这使得检测结果更具客观性和全面性，且更迅捷，这是对传统实验室检测手段的有效补充。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和指南(2018年版)》[9]也指出CMg能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临
床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，CMg应用于临床病原体诊断正变得更加全面、廉价、高效及准确[6,10]。雷傲论坛
1.2 CMg的分类
目前基于宏基因组测序的微生物分类检测技术主要包括以下两种：靶向扩增测序和鸟宏基因组测序[7]。
1.2.1 靶向扩增测序
靶向扩增测序是指对目标病原体的具有物种特异性的标志核酸序列进行测序分析以鉴别具体病原体种类，这要求操作者对目标病原体的可能分类要有初步的概念，并且针对不同种类的病原体选择不同的序列目标，例如16s rRNA对应于细菌和古生菌，18s rRNA对应于真核生物，内转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)对应于真菌等。靶向扩增测序首先需要收集临床检测标本，之后对标本中的DNA进行提取并纯化，获得包含微生物核酸以及人源核酸的混合物，再以微生物目标基因序列为样本靶向扩增出包含对应序列的DNA序列，然后将扩增后的DNA序列碎片化后再行高通量测序[11]。靶向扩增测序具备特异性高、标本量需求低、实验室操作相对简单、花费相对低等优势，且不受人源遗传信息的影响，适用于除病毒感染外的病原体分类预估把握相对高、临床标本中病原体核酸含量低或者人源遗传信息含量高的病例，但其无法呈现宏基因组中的全部基因组信息，对临床病原体的检测存在
一定的偏倚性和局限性[7]。
1.2.2 鸟宏基因组测序
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鸟宏基因组测序是指对样本中所获得全部核酸序列无偏倚地进行测序分析，其主要流程同样包括收集临床检测标本以及核酸的提取和纯化。由于标本中可能含有RNA，如需同时评估该RNA对应的病原体信息，需要将其转变为对应的cDNA。然后将含有病原体核酸、人源核酸以及可疑污染物的核酸混合物直接碎片化
并行高通量测序，因而可以获得更加全面而详细的病原体遗传信息，且无需针对可疑病原体进行预先评估和特异性准备[11]，尤其适用于怀疑病毒感染、病原体诊断困难及暴发感染等的病例[7]。但是鸟宏基因组测序结果中包含了人源核酸序列以及可疑污染物的核酸序列，需要生物信息学分析对其进行更精确解读，以利于正确的病原体判断。
宏基因组测序除具备病原体检测无偏倚性的特点外，其相较于传统检测手段最大的优势是检测时间更短。目前宏基因组测序明确病原体遗传信息的时间一般不超过48 h，平均时间约为24 h，最快仅花费9 h 即确诊致病病原体[12]，明显短于传统病原学检测方法所花费的时间(平均约3～5 d)[11]。更短的周转时间意味着临床医师可更快地评估病原体并尽早实施适当的方案，这对减少广谱抗菌药物的使用及降低患者病死率都有着极大的益处。
2 宏基因组测序在感染性疾病病原诊断中的应用
目前已有不少应用宏基因组测序成功对临床感染性疾病患者进行病原学诊断的研究报道[6,10]。研究所涉及的感染性疾病主要包括呼吸道感染、中枢神经系统感染、血流感染、骨关节感染、消化系统感染、泌尿系统感染以及眼内感染等[6]，且涉及范围和内容正不断延伸拓展。尤其在一些存在免疫缺陷的感染患者、传统检测手段反复检测仍无法明确病原体及新型或罕见病原体感染的案例中，宏基因组测序正不断显示出其特有的优越性[10,12,13,14]。
2.1 在呼吸道感染病原诊断中的应用
呼吸道感染是感染性疾病中主要的致死原因之一[3]，仅仅依靠培养等传统检测手段使其病原体诊断存在诸多困难。有学者回顾性研究了2017年4至12月采集的511份临床来源的呼吸道样本，对其进行宏基因组测序以检测病原体类型并同步对比微生物实验室培养，结果显示宏基因组测序可将病原体诊断敏感度由35.2%提升至50.7%，且在检测前已临床应用抗菌药物的病例中提升尤为显著[15]。
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病毒是呼吸道感染的主要病原体之一，但由于其种类多、变异快、实验室无法直接培养等特点，目前临床检测手段仍相当有限。早在2009年的一项研究中，日本的研究人员采集了流感流行期间不同患者的5份
鼻咽分泌物标本和3份排泄物标本，应用宏基因组测序技术成功在所有标本中都检测出了流感病毒或诺如病毒的核酸序列，其结果与同步进行的RT-PCR验证结果一致[16]。在近期的多项临床研究中，相较多重PCR、呼吸道病毒检测芯片等检测方法，宏基因组测序对呼吸道病毒感染的诊断有更高的检出率，且能发现被遗漏未检出的病毒，这主要得益于宏基因组测序的无偏倚性和高效性[17,18]。
北京全路通信信号研究设计院选择优质的临床检测标本及适当的高通量测序技术可以进一步提高宏基因组测序诊断病原体的速率。肺泡灌洗液作为呼吸道感染患者一种优质的临床检测标本类型，因为其中包含更高浓度的遗传信息，使得其在宏基因组测序的应用中具备更高的敏感度，尤其是对于病毒及真菌的检测[19]。有学者报道了1例经诸多常规检测方法仍未明确病原体的重症医院获得性肺炎病例，选取肺泡灌洗液作为检测标本，通过宏基因组测序后确证了其致病病原体为罕见的鼻病毒B91，随后患者得到了及时且合理的，最终好转出院[14]。Pendleton 等[12]在1例细菌性肺炎的病例中，选取肺泡灌洗液作为标本，并应用三代测序技术进行宏基因组测序，仅花费9 h即确诊了病原体为铜绿假单胞菌，而在同步进行的实验室培养在约23 h后方才获得阳性结果。尽管有学者提出该研究结果在实验室操作流程规范性以及结果解读等方面存在争议，但宏基因组测序所具备的高效性显示了其可进行病原学实时检测及诊断的临床应用潜力。例如，在作为重症监护室(ICU)中最常见的医院获得性感染性疾病之一的呼吸机相关性肺炎，常常因为病原学诊断困难而影响诊治，通过采集患者不同感染阶段的多份痰标本及排泄物标本送检宏基因组测序，同期对比实验室培养可更详尽地呈现病原体种类信息、含量变化以及耐药基因分布，使得这些患者获得更及时和有效的[20]。
虽然理论上宏基因组测序可应用于所有呼吸道感染的病例，但在免疫功能正常的肺炎患者中，采用更方便经济的传统微生物检测手段进行病原体的初步诊断仍然更加适用。然而在不同的宿主环境中，个体呼吸道的微生物落种类和丰度存在一定的差异，尤其是在不同免疫功能状态的体中。有学者利用二代测序技术比较发现了健康人组、HIV阳性患者组以及肺移植受者组中真菌落分布存在差异，并指出在临床实践中需有针对性地对测序结果进行判读[21]。这说明对特殊患者体，尤其是免疫功能不全的患者，需要更审慎地对宏基因组测序的检测结果进行解读。有研究发现，继发呼吸道感染的骨髓移植受者可通过宏基因组测序成功诊断多种病毒的感染，即使是在细菌与病毒混合感染的病例之中也适用[22]。此外，宏基因组测序不仅可以在肺移植受者合并呼吸道感染时做到与传统病原学检测方法，如培养、多重特异性PCR、呼吸道病毒检测芯片等，拥有一致的敏感性[23]，而且在传统检测手段无法确诊病原体的免疫功能不全以及重症患者中也可发现新的可疑病原体。
2.2 在中枢神经系统感染病原诊断中的应用
中枢神经系统感染的病原学诊断一向是一个临床难题。有统计数据显示，仅脑炎患者中约63%的病例是病原体诊断不明的[4]。对于脑炎而言，明确其是自身免疫因素还是感染性疾病导致的炎症，对于其后续的诊治方案选择具有重要意义，这更加彰显出明确病原体的重要性[9]。
宏基因组测序作为病原学诊断的一种强力工具，很早就被学者应用于中枢神经系统感染的病原体诊断
之中。2014年，1例14岁伴免疫功能缺陷的男性患者病例报告中，临床诊断为"中枢神经系统感染"，在经受包括颅脑MRI、脑组织活检在内的多种临床检测手段后均未发现致病病原体，最后通过宏基因组测序成功在脑脊液中发现了钩端螺旋体核酸序列进而确诊，并在针对病原体后好转出院[24]。
随着宏基因组测序的不断发展，成功帮助中枢神经系统感染进行病原学诊断的案例也越来越多。在2017年的1例病例报告中，临床上应用宏基因组测序技术，在排除了一系列传统检测手段获得的可疑病原体信息的干扰之后，成功确诊1例罹患神经型布鲁菌病病例[13]。另外在2018年的一项研究中，研究者在采集长期病原体诊断不明的慢性脑膜炎患者的脑脊液后，通过宏基因组测序技术成功帮助全部7例患者确诊病原体(包括2例寄生虫感染，1例病毒感染以及4例真菌感染)[25]。除此之外，还有许多成功运用宏基因组测序诊断罕见的中枢神经系统感染的病例，如猪带绦虫[26]、戊肝病毒[27]、巴氏变形虫[28]等病原体感染都被陆续报道，这说明宏基因组测序对中枢神经系统感染诊断的临床应用有着光明的前景，尤其在传统微生物检测手段无法明确病原体的病例中。
一篇关于宏基因组测序应用于脑炎病原学诊断的Meta分析中，纳入了25篇文献，共44个病例。结果显示，在28例病原体诊断不明的病例中，宏基因组测序均成功明确了病原体，其中甚至包含了5例罕见病原体感染以及5例之前从未在中枢神经感染中报道的病原体[10]。
2.3 在血流感染病原体诊断中的应用
血流感染是患者入住ICU的主要病因之一，其病情重，要求临床医师尽早明确病原体并及时开始适当的抗感染以改善预后。
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