作者：宋居易 刘昱辰 张苏楠 江高伟 杨华卫
来源：《江苏农业学报》2020年第03期
诺基亚3660
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摘要：利用反向点杂交技术，研制灵敏度较高的南美白对虾4种病原体检测试剂盒， 盐城市第一小学教育集团其检测指标包括致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（VpAHPND）、对虾白斑综合征病毒（WSSV）、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、对虾肝肠胞虫（EHP），用重组质粒分别对其进行了最低检测限测试，并与现有推荐方法进行比较。本研究研发的检测试剂盒对4种病原体的最低检测限为1 μl 10～100 拷贝。特异性检测结果表明，4种病原体彼此不产生交叉反应，特异性良好，与各病原体推荐检测方法的结果相比，阳性符合率完全一致。本研究研发的检测试剂盒具有操作方便，灵敏度高，特异性好，检测时间短，设备要求简单等特点，适合应用于南美白对虾VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的检测、篩查工作中。
关键词：南美白对虾;病原体;生物芯片法;反向点杂交技术
机械工业第四设计研究院 中图分类号：S945.4文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0656-10
Development of a rapid visualization detection kit （biochip method） for four pathogens in Penaeus vannamei
SONG Ju-yi1，LIU Yu-chen2，ZHANG Su-nan2，JIANG Gao-wei2，YANG Hua-wei2
（1.Jiangsu Institute of Agriculture Sciences for Region along the Yangtze River， Rugao 226541， China;2.Jiangsu Huntarray Biological Technology Co.， Ltd.， Nantong 226400， China）
Abstract：The reverse hybridization technique was used to develop the rapid visualization detection kit （biochip method） for four pathogens in Penaeus vannamei. The detection indices included acute hepatopancreatic necrosis disease-causing Vibrio parahaemolyticus （VpAHPND）， white spot syndrome virus （WSSV）， infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV）， Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）. The recombinant plasmid was used to test the minimum detection limit， and the results based on kits were compared with those based on the common methods. The minimum detection limit of four pathogens based on this detection kit was 10-100 copies per microliter. In addition， the results of specificity tests showed that there was no cross-reaction among four pathogens. Compared with the results of the recommended detection methods， the positive coincidence rate was completely consistent. The detection kit introduced in this study has the characteristics of easy opera
tion， high sensitivity， good specificity， short detection time and simple equipment. It is suitable for the screening and detection of VpAHPND， WSSV， IHHNV and EHP in Penaeus vannamei.
Key words：Penaeus vannamei;pathogen;biochip method;reverse hybridization technique
南美白对虾是重要的经济虾品种，具有较大的经济效益和社会效益[1-3]。有研究发现，病害对于渔业产值的影响仅次于台风、洪涝等自然灾害[4]。致对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（VpAHPND）、对虾白斑综合征病毒（WSSV）、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、对虾肝肠胞虫（EHP）是导致许多地区南美白对虾大批量死亡的主要原因之一[5-6]，对虾一旦被这些病原体侵入，便无法治愈，造成大量损失。所以从源头防止携带这些病原体的虾苗进入养殖环境极其重要，这就需要采用准确、高效、灵敏的检测手段进行检测，及时处理携带病原体的虾苗。苗种检测往往要求快速、高效、全面、准确，但是目前使用的核酸检测手段无法满足这些要求，各种分子检测手段还有很大的局限性。各病原体检测的国家标准方法及行业标准多采用PCR或者巢式PCR法，但是PCR法电价下降1分1
的最低检测限较低[7]，巢式PCR法的步骤较为繁琐，检测指标单一，并且容易产生核酸污染[8-10]。荧光定量PCR法使用染料法对病原体进行检测，无法对提取过程进行质量控制，并且在指标较多时采用熔解曲线法容易造成误读。探针法的检测指标少，对于大多数四通道的荧光定量PCR仪而言，无法实现单管检测4个以上病原体指标[11-12]，并且成本较高，不利于大规模推广。本研究拟在前人研究基础上，针对VpAHPND、WSSV、IHHNV、EHP的基因序列分别设计特异性引物、探针，构建生物芯片检测体系，以期研发出一种能够高效、快速检测这4种对虾病原体的理想试剂盒产品。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1主要试剂及仪器动物组织基因组提取试剂盒、核酸杂交液、前处理液、后处理液、杂交洗涤液1、杂交洗涤液2、显液、酸杂交晶格均购自江苏猎阵生物科技有限公司，PCR扩增试剂（10×Buffer、Taq DNA 聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、脱氧尿嘧啶、脱氧核糖核苷三磷酸）、硝酸纤维素膜购自赛多利斯集团，微孔板恒温振荡器购自杭州奥盛仪器有限公司。
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