文章编号:025420096(2006)0420340205
收稿日期:2004210212 基金项目：国家高科技术研究发展计划(863)(2001AA514024和
2002AA514010)；北京市教委项目
钱名宇，张 晶，李学凤，潘亚平，杨秀山
(首都师范大学生命科学学院，北京100037)
摘 要：为了对木质纤维素稀酸水解液进行游离细胞乙醇发酵，采用了混合菌种与不同发酵方式对稀酸水解液的乙醇发酵进行了研究。通过对1#菌和2#菌以及1#菌和3#菌两组混合菌种的驯化，得到了能耐受一定浓度的发酵抑制因子并产生较高乙醇产量的菌株。用1#菌和2#菌混合菌种以及1#菌和3#菌混合菌种进行批式发酵,72h 内乙醇产率分别为0149g Πg 和0145g Πg ，达到了理论产率的9611%和8815%。对补料批式发酵进行的初步研究也取得了比较好的结果。 关键词：木质纤维素稀酸水解液；游离细胞；乙醇发酵；补料批式发酵中图分类号:TK 16 文献标识码:A
我的妈妈从来不笑
0 引 言
稀酸水解是被广泛使用的一种木质纤维素处理产生糖的方法
[4]
。但由于木聚糖含有乙酰基，稀酸
形成乙酸。在稀酸条件下，木糖很快就会降解为糠醛，葡萄糖降解为羟甲基糠醛(H MF )，一些其他抑制因子也会在稀酸堆拇指纤维素的处理中产生，主要包括一些芳香族化合物、萜类化合物、呋喃衍生物、酚类化合物和脂肪酸、丹宁酸等。据报道011g ΠL 的糠醛就会对微生物造成抑制作用
[7]
。
由于水解液中的抑制因子对于微生物的抑制作用，所以在发酵之前需要对水解液进行脱毒处理。已经报道的脱毒方法包括碱中和处理、overliming 法处理
[8]
、活性炭吸附、离子交换树脂吸附以及煮沸蒸
发[3]
等。经过实验验证，单独用碱中和处理和over 2liming 处理的效果不好，用活性炭吸附虽然可以去除
大量的抑制因子但是相应的糖的含量也会有很大的损失，用离子交换树脂吸附则相对昂贵。综合各种方法，我们最终选择了先煮沸后用碱中和的处理方法。该方法可以有效去除一些热挥发物质及酸性物质。
除了在发酵之前对水解液进行脱毒处理外，对菌种驯化以及选择不同的发酵方式也是提高菌种对
水解液中抑制因子耐受能力的有效方法。通过对菌种进行驯化，可在乙醇产率和发酵速度方面得到很大提高。对发酵方式的改变也是提高乙醇产量的重要手段。现有的发酵方式主要有批式发酵、连续发酵和补料批式发酵。补料批式发酵是一种介于批式发酵和连续发酵之间的发酵方式
[9]
。补料批式发酵
同传统的批式发酵相比其优势明显。它可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应等。与连续发酵相比，补料批式发酵不需要严格的无菌条件，也不会产生菌种老化和变异问题。补料批式发酵现在已经被广泛的应用于发酵生产氨基酸、抗生素、维生素、有机酸、单细胞蛋白以及高聚物等
[10]
，但是将其应用于乙醇的生产还罕有报道。将
补料批式发酵应用于木质纤维素水解液生产燃料乙醇，其相对于其他发酵方式的优势：一是水解液中的抑制因子被少量分批的加入到反应系统中，可避免一次大量加入而引起的菌体代谢受到环境突然改变的影响；二是补料批式发酵有利于控制底物的浓度、控制泡沫、避免污染和控制发酵时间[11]
；三是防止
副产物的产生。
本研究通过优化水解液的脱毒方法以及对菌种进行驯化，使水解液批式发酵产乙醇取得了巨大突破，在乙醇产量明显提高的同时，发酵时间也大大缩
第27卷 第4期
2006年4月
太 阳 能 学 报
ACT A E NERG IAE S O LARIS SINICA
V ol 127,N o 14
Apr 1,2006
短。另外作者也对补料批式发酵进行了初步探索，取得了一些基本数据。补料的目的是控制微生物的中间代谢，使之朝着有利于产物积累的方向发展。在整个补料批式发酵过程中，适当的进料速度和进料量是十分重要的[12]。另外在进料的时机和间隔时间等方面也要做更为细致的控制。这也是我们以后要解决的主要问题。
1 材料与方法
111 菌种
3个菌株分别称为1#菌、2#菌和3#菌，均取自首都师范大学生命科学学院微生物学系(分别为酿酒酵母
、嗜鞣管囊酵母和大肠杆菌),-75℃的超低温冰箱的保存菌种。其中,1#菌能高效代谢葡萄糖成乙醇,2#菌能高效代谢葡萄糖和木糖成乙醇,3#菌为重组菌株，能代谢葡萄糖和木糖成乙醇。
112 培养基
1#菌、2#菌培养基：胰蛋白胨3gΠL，酵母膏215gΠL,MgS O40125gΠL,KH2PO4215gΠL,CaCl20125gΠL，葡萄糖15100gΠL,pH510～515。
1#菌和3#菌培养基：胰蛋白胨10gΠL，酵母提取物5gΠL,NaCl10gΠL，氯霉素100μLΠ100m L(浓度为4gΠ100m L)，葡萄糖15100,pH710～712。
113 木质纤维素稀酸水解液
本研究所用的木质纤维素稀酸水解液由上海华东理工大学化学工程系提供。经测定水解液原液中含有约4%葡萄糖和1%木糖。
将木质纤维素稀酸水解液原液煮沸15min，用沸水补足所失体积，用NaOH调pH值至出现最大量沉淀(pH值约为8)时，离心去除沉淀，取上清液配置发酵培养基。重建城镇
114 菌种驯化
将保藏的菌种接种于液体培养基中活化、增殖48h后经测定菌浓度为1174×108细胞Πm L(OD600= 01579)。每天向该接种的液体培养基中加入经过脱毒处理的水解液。测定乙醇的产量，直至乙醇的产量稳定。然后将水解液倒掉，并加入新鲜的培养基，重复以上步骤，直到驯化后的菌种可以持续产生较理想的乙醇产量，该菌种可作为发酵用菌种。
115 菌种的增殖培养方法
11511 1#和2#菌混合增殖培养方法
将驯化后的菌种1m L接种于100m L液体培养基中,30℃、80rpm培养24h，倒掉培养基并加入新鲜培养基，于同样条件继续培养，直到培养基中的糖消耗完全。
11512 1#和3#菌混合增殖培养方法
将驯化后的菌种1m L接种于100m L液体培养基中,37℃、120rpm培养24h，倒掉培养基并加入新鲜培养基，于同样条件继续培养，直到培养基中的糖消耗完全。
116 木质纤维素稀酸水解液乙醇发酵
利用上述菌种的游离细胞设计了以下几组实验。
11611 1#菌与2#菌混合批式发酵
发酵分两组进行，一组向驯化后的菌种中加入100m L液体培养基直接增殖培养(A瓶)；另一组从驯化后的菌种中取1m L接种于100m L液体培养基中增殖培养(B瓶)，其目的是验证经驯化的菌种是否能进行多次批式发酵。向增殖培养后的菌种中以3gΠ100m L的比例加入活性炭，用以固定菌种。测定培养基中的残糖量，确定原培养基中糖已耗尽后，保留50m L的原培养基作为接种物，并测定其中的乙醇含量(0h)。加入150m L处理后的水解液，在30℃下静置发酵。每隔12h取样，测定乙醇产量。
11612 1#菌和3#菌的混合批式发酵
兴文世界地质公园方法同11611。
11613 1#菌和2#菌的混合补料批式发酵
为了验证补料批式发酵是否能够降低抑制因子对菌种的抑制作用，本实验开始时采用未经驯化的菌种。将增殖培养后的菌种与活性炭混合，保留100m L原培养基作为接种物，共同放入反应器中(图1)。经测定，确定原培养基中已经没有残糖。在进样瓶中加入200m L处理过的水解液，通过调节使水解液进入到发酵罐中，速度恒定为712m LΠh，每天进40m L。每次进水解液前取样，测定乙醇产量。
117 分析方法
安南将军11711 糖浓度分析
用高效液相谱仪(High2liquid chromatography HP LC,Waters2690)测定样品中葡萄糖和木糖的含量。测定条件：氨柱(200×416mm)，柱温40℃,wa2 ters410示差测器，流动相乙腈：水=4:1，流速2m LΠmin，进样量20μL。
11712 乙醇浓度分析
用SP23420气相谱仪分析样品中的乙醇含量。
4期钱名宇等：木质纤维素稀酸水解液游离细胞乙醇发酵341
恒定柱温80℃，注射室温度150℃，检测器温度
qq空间v8新版50℃，进样量1μL (文中未特别说明外，已醇产量均为
体积百分含量)
。
图1
游离细胞补料批式发酵反应器示意图
Fig 11 Schematic of experimental reactor for fed 2
batch fermentation by free cells
118 乙醇产率计算方法
乙醇产率(g Πg )=(测定的乙醇产量×乙醇密度×总
体积)Π总糖的质量
2 结果和讨论
211 驯化实验
图2和图3为1#菌与2#菌混合驯化及1#
菌与3#
菌混合驯化不同批次的乙醇发酵结果。
图2 1#菌与2#
菌混合驯化不同批次的乙醇含量
Fig 12 The ethanol concentration of different batches during
the 1#
and 2#
adaptation experiment
从图2和图3可以发现，驯化后的菌株对于水解液的耐受能力有了一定的提高，乙醇产量随着驯
化批次的增加逐渐提高。1#菌与2#
菌混合菌种经过5个批次的驯化后，乙醇产量最终稳定在116%以
上，相比起始110%有了很大提高。
1#菌与3#
菌混合菌种经过5个批次的驯化后，其乙醇产量最终稳
定在112%以上，相比起始0157%也有很大提高。可见驯化可以提高菌种对于抑制因子的耐受能力
。
成都理工大学学报图3 1#菌与3#
菌混合驯化不同批次乙醇含量
Fig 13 The ethanol concentration of different batches
during the 1#
and 3#
adaptation experiment
212 发酵实验
21211 1#与2#、1#与3#
混合批式发酵
图4～7分别为1#菌和2#
菌的混合批式发酵
(A 瓶和B 瓶)及1#菌和3#菌的混合批式发酵(A 瓶和B 瓶)对水解液的乙醇发酵的结果。
图4 1#菌和2#
菌批式发酵不同批次乙醇产量(A 瓶)
Fig 14 Batch fermentation results by 1#and 2#
(A )
图5 1#菌和2#
菌批式发酵不同批次乙醇产量(B 瓶)
Fig 15 Batch fermentation results by 1#and 2#
(B )
由图4～7可以看到，无论是1#菌和2#
菌的混合发酵还是1#
菌和3#
菌的混合发酵，第二批的发
342 太 阳 能 学 报27卷
酵情况都明显好与第一批的发酵情况。这说明混合
菌种对于水解液中抑制因子的耐受性逐渐提高。1
#
菌和3#菌在36h 基本可以完成发酵,1#菌和2#
菌的发酵时间稍长，基本在48h 以后完成发酵。以第
二批发酵为例,1#菌和2#
菌A 瓶和B 瓶的72h 乙醇
产量分别为2128%和2127%,1#菌和
3#
菌A 瓶和B 瓶的72h 乙醇产量分别为2110%和2113%，两组混合菌种A 瓶与B 瓶在产乙醇能力上几乎没有差别，这证明经过驯化的菌种可以连续进行多次批式发酵
。
图6 1#菌和3#
菌批式发酵不同批次乙醇产量(A 瓶)
Fig 16 Batch fermentation results by 1#and 3#
(A
)
图7 1#菌和3#
菌批式发酵不同批次乙醇产量(B 瓶)
Fig 17 Batch fermentation results by 1#and 3#
(B )
经过测定两种不同的混合菌种在发酵72h 后均可以将水解液中的糖利用完全，残糖量接近于零。经过计算,1#
菌和2#
菌72h 发酵乙醇产率为0149g Πg ，达到理论产率的9611%,48h 为0148g Πg ，达到理论
产率的9315%,36h 为0144g Πg ，达到理论产率的8613%。1#
菌和3#
菌72h 发酵乙醇产率为0145g Πg ,
达到理论产率的8815%,36h 为0143g Πg ，达到理论产率的8413%。
21212 1#
菌和2#
菌的补料批式发酵
图8为1#菌和2#
菌对水解液的补料批式乙醇发酵结果。由图8可看出，两批补料批式发酵中依
然是第二批略好于第一批。两个批次补料批式发酵最终乙醇产量分别为1198%和2128%，乙醇产率分别为0140g Πg 和0149g Πg 达到了理论产率的7819%和9611%。由于该实验第一批发酵所用菌种未经驯化，所以乙醇产量略低。第二批发酵结果明显好于第一批
。
图8 1#菌和2#
菌补料批式发酵不同批次乙醇产量
Fig 18 Fed 2batch fermentation by 1#and 2
#
3 结 论
综合以上实验结果，可以得出下列结论：在木质
纤维素稀酸水解液的批式发酵实验中，经过驯化的1#菌和2#
菌混合发酵效果较好,72h 发酵乙醇产率为0149g Πg ，达到理论产率的9611%,48h 为0148g Πg ，达到理论产率的9315%,36h 为0144g Πg ，达到理论产率的8613%，但是发酵时间略长于1#
菌和3#
菌。1#菌和3#
菌72h 发酵乙醇产率为0145g Πg ，达到理论产率的8815%,36h 为0143g Πg ，达到理论产率的8413%。两个批次的补料批式发酵乙醇产率分别为0140g Πg 和0149g Πg 达到了理论产率的7819%和9611%，证明木质纤维素稀酸水解液的补料批式乙
醇发酵是一种可行的发酵方式，可以明显降低水解液中抑制因子对于菌种的抑制。在今后的实验中摸索出更为合理的条件将是主要的工作，相信可以达到更好的结果。
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ETHANOL PRODUCTION FROM DI L UTE 2ACID LIGNOCE LL U LOSE
H YDROLYSATES BY FREE CE LLS
Qian Mingyu ,Zhang Jing ,Li Xuefeng ,Pan Y aping ,Y ang X iushan
(Collage o f Life Science ,Capital Normal University ,Beijing 100037,China )
Abstract :Mixed strain of free cells and different fermentative m odes of batch and fed 2batch fermentation were conducted to produce ethanol from dilute 2acid lignocellulose hydrolysates.Before fermentation ,the free cells were adapted ,their ability to metabolize inhibitor was increased with increased batch time.Batch fermentation of dilute 2acid lignocellulose hydrolysates gave an ethanol yield of 0.49g Πg by 1#
and 2#
after 72h and 0.45g Πg by 1#
and 3#
after 72h corresponding to 96.1%and 88.5%theoretical ethanol yield.The astis factory results were als o achieved for the study of fed 2batch fer 2mentation.
K eyw ords :dilute 2acid lignocellulose hydrolysates ;free cells ;ethanol fermentation ;fed 2batch fermentation
联系人E 2m ail :cnu-xsyang @263
344 太 阳 能 学 报27卷
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