徐洁;刘俊许;康雪玲;蒋丽;周忠伟;陈思锋;孟丹
【期刊名称】《中国病理生理杂志》
【年(卷),期】2014(030)001
【总页数】5页(P188-192)
【关键词】聚类分析案例诱导性多能干细胞;胚胎干细胞;活性氧 【作 者】徐洁;刘俊许;康雪玲;蒋丽;周忠伟;陈思锋;孟丹
【作者单位】复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032
【正文语种】sl中 文
【中图分类】Q25
多能干细胞是具有自我更新能力和能向体内多种细胞分化的一类细胞体。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是反应活性极强的代谢分子。虽然过多的ROS会对干细胞产生毒性，引起干细胞的衰老和凋亡，但是ROS的调节在维持干细胞的干性和分化中起重要作用。ROS在不同的干细胞中发挥的作用也不尽相同。深入了解ROS如何调控干细胞的功能将有助于加强干细胞在转化医学方面的应用。本文将以胚胎干细胞和诱导性多能干细胞为主，对近年来ROS调节多能干细胞功能的研究进行简要综述。 1 多能干细胞
干细胞是具有自我更新能力和能向体内多种细胞分化的一类细胞体。根据干细胞增殖能力和分化潜能的不同，可以把干细胞分为具有无限增殖、分化潜能的多能干细胞 (pluripotent stem cells)和增殖、分化能力有限的成体干细胞(adult stem cells)。多能干细胞主要包括胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESCs)和诱导性多能干细胞(induced plurip
otent stem cells，iPSCs)等。这些细胞具有在体外特定的培养条件下无限增殖和分化为机体内任何种类细胞的潜能。因此，多能干细胞在再生医学领域有巨大的应用潜力和优势［1］。ESCs是动物早期发育囊胚期内细胞团细胞在体外特定培养条件下获得的永生细胞［2］。iPSCs最初是 2006 年由 Takahashi等［3］研究小组把4种与维持胚胎干细胞全能性相关的基因(Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4)通过逆转录病毒载体转入小鼠的成纤维细胞，使其重编程而获得。随后，人的iPSCs也从多种体细胞获得［4］。iPSCs表现出许多与ESCs相同的特点:包括形态，基因表达标志物以及在体内的全能性［5］。iPSCs可用于建立疾病细胞模型，研究疾病的发生机制和进行药物筛选［6］。目前，干细胞已经用于临床相关疾病，因此iPSCs在干细胞方面有着非常广阔的应用前景。 2 活性氧
ROS是反应活性极强的代谢分子，主要包括超氧阴离子(O－·2)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)。生理情况下，细胞内ROS的产生主要来源于线粒体。线粒体氧化磷酸化过程中产生较低水平的超氧阴离子，随后其很快被超氧化物歧化酶转化成过氧化氢。过氧化氢相对于超氧阴离子而言比较稳定，可被谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶水解。此外过氧
化氢也可通过Fenton反应转化成化学性质更活泼的羟自由基。过多的ROS会对细胞产生毒性，引起细胞的衰老和凋亡，许多疾病如动脉粥样硬化、心衰、高血压、糖尿病、帕金森病和衰老等，都与ROS产生过多有关［7-8］。但是低水平的ROS可作为许多刺激因子的第2信使，参与调节细胞的迁移、增殖、黏附、分化等多种生理功能。NADPH氧化酶是干细胞产生ROS的主要来源之一。NADPH氧化酶主要由跨膜结构(Nox和p22phox)和胞浆成分(p47phox、p67phox、p40phox及 Rac1)组成［9］。近年来研究发现，NADPH氧化酶来源的ROS参与调控干细胞(或祖细胞)的多种功能，包括干细胞的增殖、迁移、干性维持、分化以及基因表达［7-8，10-15］。因此，深入了解ROS如何调控干细胞的功能将有助于加强干细胞在转化医学方面的应用。
劳工部3 ROS在多能干细胞中的作用
近年来，科学家们对ROS在多能干细胞中的作用进行了广泛的研究。尽管ROS在不同的干细胞中发挥的作用不尽相同，但是科学家们基本得出一个共识:ROS水平的变化参与调控干细胞的功能和命运。干细胞氧化还原调节的改变在疾病的发病机制中起重要作用。
3.1 ROS对ESCs和iPSCs黏附、增殖、衰老和凋亡的影响 生理情况下，低水平的ROS在
维持多能干细胞的正常功能中起重要作用。但是过高水平的ROS可造成多能干细胞的损伤和自我更新、黏附、增殖、迁移等功能失常，加速细胞衰老与凋亡［5，7，16-22］。例如:血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)能够保护细胞免受氧化应激导致的细胞损伤，而HO-1基因缺陷型的iPSCs内ROS水平增高，对氧化应激引起的细胞凋亡更敏感［5］。我们最近的研究发现，H2O2通过减少黏附相关基因如integrin alpha 7、cadherin 1、cadherin 5和VCAM-1等基因的表达，抑制iPSCs的黏附，黏附的功能缺失影响了iPSCs迁移的能力;同时H2O2的暴露抑制了iPSCs的增殖功能，诱导细胞的衰老和凋亡［14］。以往的研究也证实，H2O2抑制ESCs的黏附和细胞周期蛋白cyclin D1的表达，引起细胞周期阻滞并诱导凋亡［23］。ROS影响细胞黏附的机制可能与抑制整合素依赖的细胞信号转导途径有关［14，24］。
同时，很多研究证实:减少或抑制干细胞内ROS的产生，能阻断ROS诱导的多能干细胞功能的失常。白藜芦醇能够显著增加小鼠iPSCs内锰超氧化物歧化酶(MnSOD)的表达和细胞内谷胱甘肽的水平，因此减少氧化应激导致的 iPSCs损伤［22］。飞燕草素(delphinidin)，一种具有抗氧化特性的植物素，可以通过减少小鼠ESCs内 ROS介导的JNK和NF-κB的激活，抑制低氧诱导的 ESCs凋亡［25］。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystei
ne，NAC)，一种自由基清除剂，也能通过抑制ROS产生，抑制在iPSCs向血细胞分化过程中细胞的衰老和凋亡［20］。
3.2 ESCs和 iPSCs自身的抗氧化性 针对过量ROS对干细胞生理和功能的毒害现象，一些研究表明:多能干细胞相对于成体细胞而言，具有更强的抗氧化能力。人ESCs和iPSCs主要是通过增加ROS的清除能力和减少ROS产生来维持干细胞基因组的完整性［7，16］。在人的 iPSCs产生过程中，线粒体基因组的拷贝数明显减少，从而使得ROS产生减少，并且iPSCs的抗氧化基因表达增高，这与ESCs的情况极为相似［16］。研究证实:ESCs通过增加端粒酶活性、增强自身的DNA修复能力以及抗氧化能力，从而维持干细胞的干性［26］。最近的一项研究也证实，小鼠的ESCs对于短暂的H2O2诱导的衰老是有抗性的［23］。
然而，我们新近的研究发现iPSCs对氧化应激引起的细胞毒性较敏感，H2O2浓度大于25 mmol/L时就可以引起小鼠iPSCs阻滞在G2/M期，并诱导细胞的衰老和凋亡;而相比之下成体成纤维细胞在H2O2大于150 μmol/L才明显加速衰老、凋亡，至H2O2浓度为400 μmol/L 时出现快速的死亡［14］。Guo 等［23］也报道与成纤维细胞和血管平滑肌细胞比较，E
SCs对H2O2引起的细胞毒性更敏感。另有研究证实，短暂的非毒性剂量的H2O2暴露就可以引起干细胞胰岛素抵抗信号通路的转化，以及糖尿病和肿瘤发生途经的诱导激活［27］。可见，不同类型的细胞对H2O2引起的氧化应激有不同的反应和耐受。这些研究结果的不一致可能与细胞密度和种类、H2O2干预的浓度和时间等实验条件的不同有关。另一方面，尽管通常干细胞比成体细胞有更强的抗氧化性，但在创伤应激或ROS调节基因缺陷的情况下，ROS耐受阈值较低的iPSCs和ESCs可能更倾向于积累超过其耐受量的ROS，从而对ROS的细胞毒性更加敏感。当氧化应激超过了多能干细胞耐受的能力时，干细胞通过衰老或凋亡途径清除损伤的细胞以保证基因组的完整性。
3.3 ROS对 ESCs和 iPSCs分化的影响 ROS在ESCs和iPSCs的分化中也起着重要的作用。低水平的ROS是维持人和小鼠干细胞自我更新所必须的，增高的ROS水平则会促进干细胞的分化［7，28］。在多能干细胞向不同种类细胞分化的过程中，ROS所起的作用也有所不同，甚至截然相反。一些研究表明，ROS 促进 ESCs和 iPSCs 的分化［5，29-30］。在对ESCs向心肌细胞分化的研究中发现，高糖环境(25 mmol/L)通过增加Nox4表达促进ROS生成，进而激活p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，促进 ESCs向心肌细胞分化;而在生理水平糖浓度(5 μmol/L)的培养基中，ESCs无
法被诱导分化成心肌细胞［30］。其中，Nox4是NADPH氧化酶的一个重要亚基，Nox4蛋白表达的增加可直接激活NADPH氧化酶，促进细胞ROS产生。Nox4产生的ROS在ESCs向血管平滑肌细胞分化的过程中也起重要作用。转化生长因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)可激活 Nox4，促进Nox4转移到ESCs核内产生ROS，进而促进血清反应因子(serum response factor，SRF)与心肌蛋白(myocardin)形成复合体，促进血管平滑肌细胞的分化［29］。此外，在 HO-1 基因缺陷型的 iPSCs，由于ROS水平的增高，其比正常的iPSCs更易失去多能性，更易发生自发性分化［5］。类似地，ROS也促进iPSCs分化成神经细胞，其与ROS激活ERK1/2信号通路有关［15］。
但在另一些情况下，ROS会阻碍ESCs和iPSCs的分化，ESCs和iPSCs分化成骨细胞和造血细胞的过程揭示了ROS在干细胞分化中的阻碍作用。白藜芦醇通过降低ROS的水平能够在1～2周内显著上调鼠iPSCs类成骨分化时的成骨标志物Runx2、osteopontin等，显示了多余的ROS可能阻碍 iPSCs分化成骨细胞［22］。在另一个研究中，iPSCs用NAC处理后，CD34、CD43、CD45等血细胞标志物阳性的细胞数量大大上升，提示抑制ROS水平能够促进iPSCs向造血细胞的分化，揭示了ROS本身对iPSCs血细胞细胞分化的抑制作用［20］。
目前，在ROS的调控下，ESCs和iPSC可诱导分化成心肌细胞、血管细胞、神经样细胞、脂肪细胞、造血细胞和骨样细胞等等［22］。ROS水平的变动在某些情况为多能干细胞的分化提供了条件，而在另外一些情况下却促进了去分化，这些具体的调控机制仍有待进一步研究。
夺命连线>分子筛
4 ROS相关的干细胞疾病模型
电网谐波治理装置ROS相关的基因缺陷的ESCs可以导致疾病的发生。而对于iPSCs来说，从病人身上提取的细胞可以被诱导成iPSCs，从而提供较好的研究疾病发生机制和药物筛选的模型。这里我们介绍一些利用iPSCs建造的疾病模型。
ROS相关基因缺陷的先天疾病的iPSCs模型能够给疾病的发病机制和带来新的思考。如:科凯恩综合征(Cockayne syndrome，CS)是一种以提早老化和DNA修复功能缺陷为特点的人类基因疾病。为了更深入地了解该疾病的发病机制，科学家们用病人的成纤维细胞制成了iPSCs。来源于CS的iPSCs表现出了高于正常情况的细胞死亡率、高水平的ROS产生、硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的上调和p53在转录水平的上调［18］。另一个先天疾病的例子是X染体连锁的慢性肉芽肿性疾病(X-linked c
hronic granulomatous disease，CGD)，这类病人的中性粒细胞是NADPH氧化酶缺陷型的，因此这些细胞不能有效消化被胞吞和胞饮的内容物，逐渐形成了肉芽肿［31-33］，目前造血干细胞移植术是针对该病的唯一一种有效手段［33］。通过将病人的成纤维细胞重编程成 iPSCs，可以建立CGD的疾病模型。研究表明，由这些iPSCs分化而成的巨噬细胞内尽管缺乏ROS，它们具有正常的吞噬能力，提示了巨噬细胞内可能存在相关补偿机制，这些发现为该病的提供了一些新的思路［31］。另一方面，某些iPSCs疾病模型提供了一些证明发病可能与ROS调控相关的证据。例如在帕金森综合症中，从该病病人身上分离的细胞诱导成的iPSCs，其抵抗氧化应激的能力是下降的。此外，暴露于ROS中的ESCs和iPSCs倾向于获得胰岛素抗性，这可能会成为糖尿病的模型［7］。除了建立和研究疾病模型，运用到iPSCs的方法方兴未艾，目前在镰状红细胞贫血症、血友病A、肝病、帕金森氏病、急性心肌梗死、糖尿病等疾病的中都有成功的案例［34］。如白藜芦醇在iPSCs骨向分化中的作用为骨整形手术的干细胞法提供了思路［22］。通过有效地调节ROS，由H9c2细胞重编程获得的iPSCs能够抑制细胞凋亡、被诱导分化成心肌细胞，并且在心肌梗死的心脏经历iPSCs手术后显著增多了血管平滑肌细胞和内皮细胞［35］。一个最近的研究迈出了令人振奋的一步——iPSCs能够被诱导分化成心血管主要
细胞成员中的每一种细胞，包括平滑肌细胞、内皮细胞、血管壁细胞和心肌细胞等，使iPSCs在心血管再生医学方面具有更广阔的应用前景［21，35］。
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