概述
PTIO（2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide radical）是一种与人体自由基相似的自由基，常温下是蓝晶状固体，化学性质稳定，但对光敏感，易溶于水和大多数有机溶剂,具有良好的稳定性，在560nm下有特征吸收峰，会因为自由基的清除而导致颜变浅，吸光度值降低。因此可用于抗氧化实验研究。
图1：PITO自由基
图2：PITO自由基模型（球棍模型）
图3：PITO自由基模型（棍式模型）
异补骨脂乙素( Isobavachalcone，IBC) 最早是由Bhalla 等于 1968 年从补骨脂的果实中提取出来的一种活性成分，异补骨脂乙素属黄酮类中的查尔酮类，具有抗炎、抗菌、抗氧化等生物学活性。补骨脂中黄酮类成分母核不同，是否有羟基和异戊二烯基取代以及取代位
置差异，都会影响其对绝经后妇女成骨细胞的增殖、分化活性。
图4：异补骨脂乙素结构式
图5：异补骨脂乙素分子模型
异甘草素 (Isoliquiritigenin，Iso) 是甘草中活性最好的黄酮苷元化合物，在抗肿瘤、抗氧化、解痉、保肝等均具有广泛的药理作用，甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗艾滋病、抗溃疡、抗炎等作用。
图6：异甘草素结构式
图7：异甘草素分子模型
两者均有良好的抗氧化能力，故可用于PTIO自由基清除能力教学。故本实验选取了这两种化合物做PTIO自由基清除能力测定的实验对象。
仪器与试剂
数字通信技术1.仪器
旋转蒸发仪，紫外分光光度计，电子分析天平（十万分之一），离心机，冰箱，恒温水浴锅，真空冷冻干燥机，旋转蒸发仪，超声清洗器，电热恒温鼓风干燥箱，移液器及头；西林瓶、锥形瓶、离心试管等玻璃器皿。
2.试剂
PTIO标准品、Na2CO3、蒸馏水，异补骨脂乙素，异甘草素，甲醇等。
实验步骤
参考至文献[1],并根据实验的实际情况做了修改。
1.PTIO测试液制备
取PTIO固体约1g放于20ml蒸馏水中，超声5min，上下震荡使其混合均匀。取80ul该PITO溶液加20μL蒸馏水，在560nm处测定吸光度值。使A-A空板＝A0=0.1±0.01之间。若A0偏大，则加蒸馏水稀释；A0偏小，可略加PTIO固体，务必使A0符合要求。该PTIO溶液最好
避光保存，一天内用完。（放冰箱可保存一周左右，但不推荐）
此处用NA2CO3、亚硫酸氢钾、没食子酸、来调节溶剂PH（在不同pH值下生理活性不一样，如7.4，7.0，6.0，5.0，4.0共计5种pH值，测定不同pH值下样品的清除率，pH值的影响实际上就是质子转移）以探索不同pH值对样品清除率的影响肉桂酸
2.样品液的配置
样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品极性选择，首选95乙醇，必要时可以将样品溶液稀释到0.5mg/mL，0.25mg/mL甚至更小
3预实验
取PTIO溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪情况，当溶液颜基本褪去时，记下样品加样量，此为样品最大用量，再次基础上，往前设置五个用量，使之成为等差数列。（最大用量最好10ul≤x≤20ul）若无褪情况，则37°C烘箱30min后在观察
4测量A值
用移液移取PTIO溶液80μL加入到96孔板，加样品液xμL（x是根据上一步预试结果确定样品液的用量），再加（20-x）μL甲醇混合，37°C烘箱30分钟后，测A值（560nm），每个浓度取三个平行测量数据。保留三个平行测量数据，保存并记录数据
表1：加样用量示例（最大加样量为10μL）
样品液 | PTIO测试液 | 甲醇 | 总体积 |
2μL | 80μL | 18μL | 100μL |
4μL | 80μL | 16μL | 100μL |
6μL | 80μL | 14μL | 100μL |
8μL | 80μL | 12μL | 100μL |
10μL | 80μL | 10μL | 100μL |
| | | |
5PTIO清除率（抑制率）的计算
清除率 ＝ （1- A / A0）*100
实验结果（以异补骨脂乙素和异甘草素为例：）
A0 是80μL PTIO加20μL水测得的吸光度，每测一种样品需重测A0 值。 当清除率为50%时所对应的样品浓度则为该样品的IC50值。取三个平行数据的清除率平均值为纵坐标，浓度为横坐标，绘图。得到以下图：
Concentration μg/mL
图8. 不同pH-PTIO自由基清除率对比 （异补骨脂乙素）
Concentration μg/mL
图9. 不同pH-PTIO自由基清除率对比 （异甘草素）
选用相同的测定波长和反应时间，测定梯度浓度的两种中药样品溶液对PTIO自由基的清除率，计算相应中药的IC50值，再对其抗氧化活性进行对比评价，根据3个平行实验得到的
平均IC50值如下表：在线水分检测
表2谢尔宾斯基地毯.异补骨脂乙素和异甘草素清除PTIO自由基的IC50均值（μg/mL）
| pH7.4 | pH7.0 | pH6.0 | pH5.0 | pH4.0 |
异甘草素IC50均值 | 14.91 | 16.75 | 小笠原岛 7.28 | 23.56 | 19.59 |
异补骨脂乙素IC50均值 | 25.18 | 27.32 | 23.03 | 21.30 | 19.87 |
骨丢失 | | | | | |
我们通过预实验，得到异补骨脂素与异甘草素最佳用量均为1mg/mL。根据选定的测定波长和反应时间，测定一系列样品浓度（倍比稀释）的异补骨脂乙素和异甘草素对PTIO自由基的清除率，再计算相应的IC50值，并对其抗氧化活性进行对比评价。根据以上图表可知：第一，异补骨脂乙素和异甘草素在不同pH值下均能有效清除PTIO自由基。但二者的IC50值，均随溶液的pH值而改变。第二，异甘草素在pH值为6.0时消除PTIO自由基的能力最强，异补骨脂乙素在不同的pH值下消除PTIO自由基的能力相当。从清除PTIO自由基的能力来说，异甘草素>异补骨脂乙素。
参考文献
[1] Xican Li*. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide (PTIO•) Radical-scavenging: A New and Simple Antioxidant. Journal of Agricultural & Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297
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