黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力

发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定)

一、实验目的

1、了解SOD活性测定的原理

2、学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性

二、实验原理

原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD 的活力。操作步骤：如表2-1。

三、实验试剂

跪族男孩硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。

四、实验步骤

lgkg70

试剂	测定管	对照管
75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）	0.55	0.55
待测样品（ml）	A(取样量)	0
0.1mol/L 盐酸羟胺溶液	0.05	0.05
75mmol/L 黄嘌呤溶液	0.05	0.05
0.037U/L 黄嘌呤氧化酶	0.05	0.05
双蒸水	0.2－A	0.2
用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min。
显剂（ml）	1	1
总体积1.9ml，混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，测A530

五、计算方法

计算公式：每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算：

SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%

SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数

式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值

六、注意事项：

1.盖革模式试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。

2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。

常用试剂

（1）诱导剂：分别配制 IPTG 100μmol/mL； CuSO4·5H2O 250μm/mL； ZnSO4 100μm/mL。分别于0.22μm滤膜过滤除菌。

（2）稀释菌体所用0.02mol/L pH7.4 PBS 缓冲液： 8.5gNaCl，0.2gKCl，Na2骗人的把戏HPO4·12H2O，3.628g，0.27gKH2PO4，定容至1000ml。

（3）SOD活性测定

①75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）母液配制：A：0.15mol/L K2HPO4 配置：准确称取17.115g K2HPO4·3H2O 溶于500mL 蒸馏水中。B：0.15mol/L KH2PO4 配置：准确称取2.041g KH2PO4 溶于100mL 蒸馏水中。取母液A 91.5mL 与母液B8.5mL 充分混合后，用水稀释至终体积200mL，用酸或碱调pH 至7.8。

②0.1mol/L 盐酸羟胺溶液（要求新鲜配置）准确称取6.949g 盐酸羟胺溶解于1ml 蒸馏水中。