摘要黄酮类化合物具有多种生物学功能，如清除自由基和抗氧化作用、抑菌、抗病毒、抗癌和抗肿瘤，防治心血管疾病、肝病均有一定的疗效，对细胞凋亡产生抑制(或促进)作用，对畜禽生产也有良好的促进功能。本文介绍邻苯三酚自氧化法和水杨酸法比法测定植物中黄酮类化合物方法，及其清除超氧阴离子自由基(O-2)和羟基自由基(OH)的效果，以及黄酮类化合物的还原能力，对DPPH自由基的清除能力，对Fe2+的络合能力和脂质体过氧化反应的抑制作用。并考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度及提取级数5个单因素对紫黄酮提取率的影响。 关键词黄酮类化合物；抗氧化性；Fenton反应；邻苯三酚自氧化法
黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物。黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在[1]。黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基原酮）为母核而衍生的一类黄素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物[2]。研究表明[3]，黄酮的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A和1个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇、黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）、异黄酮和异黄烷酮（又称二氢异黄酮）、查耳酮和二氢查耳酮、橙酮（又称澳咔）、黄烷和黄烷醇及黄烷二醇（3，4）（又称白花苷元）、花（）[又称2-苯基苯并吡（喃）][4]。
黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，这些化合物用于防治心脑血管疾病，如能降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛、扩张冠状血管，增加冠脉流量。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，同时具有护肝、解肝毒、抗真菌、急、慢性肝炎、肝硬化及抗自由基和抗氧化作用。除此之外，黄酮类化合物还具有与植物雌激素相同的作用[1]。如，地果具有清热、利湿、活血、解毒、消积作用，临床用于风热咳嗽、痢疾、水肿、黄疸、风湿痹痛、痔疮出血、闭经、带下、跌打损伤、无名肿毒及小儿消化不良[5]，银杏黄酮、山楂黄酮、茶叶黄酮等诸多产品[6]，杏仁皮为杏仁红棕或深黄种皮可入药，且含黄酮、纤维素等多种活性物质[7]。在畜牧业动物生产上，黄酮类化合物的应用能显著提高动物生产性能，提高动物机体抗病力，改善动物机体免疫机能[1]。
1 黄酮类化合物的抗自由基和抗氧化作用
1.1 自由基的危害
自由基，化学上也称为游离基，是含有一个不成对电子的原子团。体内活性氧自由基具免疫和信号传导功能，但过多的活性氧自由基产生会导致产生一系列不良反应，导致人体和动物机体正常细胞和组织的损坏，Chung 等[8]认为，自由基对人体的危害主要是对组成细胞脂蛋白和原生质膜的多不饱和脂肪酸(PUFA)的氧化，导致膜流动性丧失、受体错位、细胞溶解、含硫酶及一些蛋白质的失活、交联或
变性等，进而破坏细胞DNA，从而引起诸如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等。此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多活性氧自由基，使核酸突变，这是人类和动物衰老和患病的根源[8]。
1.2 黄酮类化合物的抗自由基及抗氧化活性
黄酮类化合物（Flavonoids）又称生物类黄酮（Bio-flavonoid），是存在于自然界的一大类化合物。许多研究表明，生物类黄酮具有多种生物活性[8]，具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、改善微循环、抗肿瘤等功效，其抗氧化作用也早已被人们所重视。大量研究表明，黄酮类化合物有提高动物机体抗氧化及清除自由基的能力。黄酮类化合物因酚羟基上的氢原子可与过氧自由基结合生成黄酮自由基，进而与其他自由基反应，从而终止自由基链式反应[6-7]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是机体重要的抗氧化系统成员，它能清除超氧阴离子、自由基保护细胞免受损伤，而谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathion Peroxidase，GSH-Px ）可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[8]。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是氧化应激反应中脂质过氧化的产物，其下降反映脂质过氧化的减少[9]。黄酮类化合物能很好地提高SOD 和GSH-Px的生物学活性，明显降低MDA水平[10]，并呈剂量-效应关系[11]，从而显著提高动物机体的抗氧化能力[12-16]。大豆黄酮和染料木素能显著（P < 0. 05）提高GSH-PX活性，在一定浓度范围内能促进奶牛乳腺上皮细胞抗氧化水平[17-18]。通过研究山楂叶总黄酮（FHB）对胰岛素抵抗大鼠高血脂、氧化损伤及脂肪肝的防治作用发现，
FHB组和模型组比较，可以显著提高总抗氧化能力和肝脏组织中SOD活性，降低MDA含量。
对体外黄酮类化合物清除2，2-二苯基-1-苦味酰基自由基（DPPH）体系、羟基自由基体系、烷基自由基引发的亚油酸氧化体系、超氧阴离子自由基体系、过氧化氢反应体系及抗氧化活性进行研究，发现黄酮类化合物在试验浓度范围内对上述自由基体系及氧化体系的清除率为90% 左右[19-21]，维生素C（VC）和维生素E（VE）等对黄酮具有明显的协同抗氧化作用[22-23]。多甲氧基黄酮单体对亚油酸及脂质体的氧化性有一定的抗性，对氢氧根离子（OH-）有清除作用[24]。无梗五加果树脂纯化后的总黄酮具有抗油脂氧化、清除羟自由基和超氧自由基的能力，随总黄酮浓度的增加，其抗油脂氧化、清除自由基的能力随之增强[25]。
承担民事责任的方式
2 样品的制备
2.1 乙醇提取黄酮类物质
乙醇提取黄酮类物质的一般步骤如下：
样品→清洗→干燥→粉碎→过筛→称取粉末→石油醚脱脂→加入60% 乙醇提取2 h，重复三次→过滤→合并滤液→浓缩→干燥→黄酮类化合物。
此类方法是最常用的最普遍的提取方法如，谭萍[26]等实验中进行的苦荞黄酮类化合物的提取纯化，
向红实验中地果黄酮的提取，郭豫梅对石参样品就是在干燥箱中70℃干燥，粉碎，过100目筛。用天平精密称取50.2406g样品，用体积分数80%的乙醇超声提取2 h，再将提取液减压浓缩，真空干燥，李琼[27]对芸豆种子的黄酮类物质的提取就是将新鲜的芸豆种子于65℃的烘箱内烘干至恒重，粉碎后过60目筛，备用。准确称取芸豆种子1g干重粉末于100ml圆底烧瓶中，并在烧瓶中加入30ml 70%的乙醇溶液，将烧瓶置于65℃的水浴锅中，水浴浸提2.5h，过滤，并用70%乙醇定容至50ml得到芸豆种子的黄酮提取液[28]。
2.2 超声波法提取黄酮
回瑞华[29]等称实验中，取1 g洋葱样品，以15 mL 80% 乙醇于50 mL锥形瓶中，在10 的水浴中超声提取3次，每次15 min，合并滤液旋转蒸发除去溶剂，得到提取浸膏，移入50mL容量瓶中，定容至刻度。其在2007年，也使用该方法提取了迎春花的黄酮类物质，操作步骤：精密称粉碎后的迎春花2.00 g，放入锥形瓶中，加入95%乙醇20mL，在冰水浴中用超声波振荡器振荡20min，将提取液过滤至100mL容量瓶中，残渣再重复振荡提取2次，3次滤液合并，用95%乙醇溶液定容至刻度，备用。
3 黄酮类物质的测定
3.1 吸收曲线的绘制及测定波长的确定
3.1.1 紫外光谱吸收曲线的绘制及测定波长的确定
吸取0.25mL至10mL容量瓶中，用80%乙醇定容至刻度，以80%乙醇溶液为参比液在200-800 nm范围内扫描，得到其吸收光谱最大吸收波长。如回瑞华[31]2010年从槲皮素黄酮标准储备液中准确吸取0.20mL于10mL容量瓶中，以80%乙醇溶液定容至刻度，以80%乙醇溶液为参比液在200 ~ 800 nm范围内扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长为256 nm。
3.1.2 可见光谱吸收曲线的绘制及测定波长的确定
吸取样品0.25 mL至10mL容量瓶中，以1.5% FeCl3溶液定容至刻度，以1.5% FeCl3溶液为参比液在200~ 800nm范围内扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长。如回瑞华[29]2010年从槲皮素
黄酮标准储备液中准确吸取0.20mL于10mL容量瓶中，以1.5% FeCl3溶液定容至刻度，以1.5% FeCl3溶液为参比液在200~800 nm范围内扫描，得到其吸收光谱，最大吸收波长为457 nm。
3.2 地果黄酮含量的测定
3.2.1 标准溶液的配置
准确称取标准品10.0mg，加95%乙醇溶解定容至100ml，从中准确取10.0ml于100ml容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，浓度为0.01mg/ml。
3.2.2 地果黄酮含量的测定
工程设计学报
用移液管准确吸取标准液1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml 分别置于10ml比管中，加入5%AlCl3乙醇溶液各1.0ml，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置20min后，以试剂空白作参比，用360～500nm波长范围的最大吸收波长测吸光度，绘制标准曲线。取提取液各1.0ml，于3个10ml 比管中，再分别加入1.0ml 5%AlCl3乙醇溶液，用95%乙醇定容至10ml，摇匀，静置20min，用最大吸收波长测吸光度，代入标准曲线确定黄酮含量。或者为分别精密量取待测液0.1ml加入9.9ml的30%乙醇，置于25ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0ml摇匀，放置6min，10%硝酸铝溶液1.0 ml摇匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠溶液10.0ml用30%乙醇稀释至25ml放置15min后置比皿中，以试剂同法操作作为空白，在波长510 nm处测定吸光度。通过回归方程计算出溶液浓度(C ) (mg/ml )。再计算样品中总黄酮含量：
1-溴芘T = C×10×N×50/5000
式中，N为各样品相应的稀释倍数；T为样品中总黄酮百分含量[30]。
3.2.3 邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-luminol发光体系及其测定
在比管中分别加入5 10- 5 mo l/L的邻苯三酚溶液、pH为9.95的碳酸盐缓冲溶液(含浓度为0.2mmol /L的luminol)，启动IFFM-D型流动注射化学发光仪，按连接流路，流速均为2.5 mL /m in，测出邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-luminol发光体系的发光，测3次，取峰值平均值进行定量。发光强度以计数表示。
3.2.4 氧化性测定及抑制率计算
按3.2.3所采用的发光体系，测定一系列浓度迎春花的抑制后的发光，分别测定3次，同样取峰值平均值进行定量。发光强度以计数表示。以邻苯三酚-碳酸盐缓冲溶液-luminol发光体系的发光强度为空白发光峰值，可计算出加入迎春花后抑制发光的程度[31]。
p m 2.5抑制率(% )的计算: (空白发光峰值- 加迎春花后的发光峰值) /空白发光峰值×100%。
3.2.5 Fe2+络合能力的测定:
参考文献[32]中方法进行。
3.2.6 还原能力的测定
参考文献[33]中方法进行，以没食子酸、VE、BHT 为对照，试验重复三次，取平均值。
3.2.7 脂质过氧化抑制作用
脂质体的制备：卵磷脂1g溶解于50mL磷酸盐缓冲溶液中( 0.02M pH = 7.4)充入CO2封口，置于超声波清洗机中混合均匀，4℃保存待用。脂质过氧化活性的检测[35]：0.1mL 样品混合于1mL 脂质体中，加
入0.5mL 0.05mol /L的FeSO4溶液，1.2 mL磷酸盐缓冲溶液(0.2mol /L pH =7.4)，37℃水浴2 h。加入1%的硫代酸溶液1mL，10%的盐酸溶液1mL，100℃水浴30 min后冷却，加入5mL氯仿，3000 r/min，离心20min，在532 nm下测吸光率。
4 黄酮类化合物的抗氧化性
4.1 黄酮类化合物对羟自由基的清除作用
黄酮类化合物对羟自由基的清除(λmax=510nm)率90.24%。在Fe2+-H2O2-邻二氮菲体系中，未加H2O2之前，Fe2+与邻二氮菲形成红配合物，加入H2O2后，Fe2+减少，配合物颜变浅，再加入提取液，提取液中所含的黄酮类化合物与OH结合，阻止了羟自由基继续氧化Fe2+，根据黄酮类化合物抗氧化能力不同，使体系中Fe2+浓度不同，所显示的颜深浅也不同[34]。谭萍[26]等的苦荞种子黄酮类化合物的抗氧化作用的试验中，苦荞种子黄酮类化合物对羟基自由基也有抑制作用，且抑制率在0.008~ 0.013μg/ mL的浓度范围内是随着黄酮浓度的增大而增大的，当浓度为0.013μg/ mL时，抑制率达到最大，为8.65%。
滑县县志4.2 黄酮类化合物对超氧离子自由基O-2的抑制作用
黄酮类化合物对超氧离子自由基O-2的抑制率为50%。在Fe2+-H2O2-邻二氮菲体系中，未加H2O2之
卫星场强图前，Fe2+与邻二氮菲形成红配合物，加入H2O2后，Fe2+减少，配合物颜变浅，再加入提取液，提取液中所含的黄酮类化合物与OH结合，阻止了羟自由基继续氧化Fe2+，根据黄酮类化合物抗氧化能力不同，使体系中Fe2+浓度不同，所显示的颜深浅也不同。在邻苯三酚体系中，邻苯三酚的自身氧化速度比较快，在加入了提取液后，由于黄酮类化合物含有活泼的3’、4’位酚羟基，能提供活泼的氢，从而阻断自由基反应，因此，抗氧化是通过供氢来完成清除O-2反应。
谭萍[26]等的苦荞种子黄酮类化合物的抗氧化作用的试验中，每隔30 s 所测邻苯三酚自氧化的吸光度分别为0.037 ( 30s) 、0.049 ( 60s ) 、0.060 ( 90s) 、0.070 ( 120s)、0.080( 150s) 、0.090( 180 s)，邻苯三酚自氧化平均吸光度A0= 0.064。分别取苦荞种子黄酮提取液0.002mL、0.004mL、0.006mL、0.008mL放入10mL容量瓶中，用70%的乙醇稀释至刻度，作为不同浓度的苦荞种子黄酮类化合物的样品液，分别标示为样品1~4。从每隔30s所测加入苦荞种子黄酮类化合物后邻苯三酚自氧化的吸光度。苦荞种子提取液对超氧阴离子自由基( O-2)的抑制率根据公式计算，所得
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