44微生物学杂志2020年12月第44卷第2期JOURNAL OF MICROBILLOGY Dee.2020Vol,44No.6新型冠状病毒3C样蛋白酶结构和功能特征分析 戴姿薇，唐标**
(湖南中医药大学医学院，湖南长沙412208)
摘要采用生物信息学方法分析新型冠状病毒(Severe aceto respiratoy syad r ome coronavirus2,SARS-FoV-
2)3C样蛋白酶(3-chymotypsin-Fke protease,307")的理化性质、结构与功能，为抗SARS-FoV-5药物研发提供
参考。通过ProtParam、ProtUcaW、BioeVit服务器对3CL2ic进行一级结构如氨基酸理化性质、疏水性的预测分析； COILS Server、SignaW、TMPreP、TargetP Server、NetPhos Server、NetNGWc Server服务器对3C l2"1结构进行如卷曲螺旋区、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点的预测分析；sopma、SWISS-MODEL服务器对3cl210进行二级结构、三级结构的预测分析；IEBD对3cl210进行B细胞表位的预测分析。3CL uic由306个氨基酸组成，其中亮氨酸占比最高，分子质量为33776.64，理
论等电点值为5.65，半衰期为1.6h，脂肪系数为
82.32；亲水性较高，不具有卷曲螺旋区与信号肽特点，含一个跨膜区；具有4个磷酸化位点，2个糖基化修饰
点；二级结构中无规则卷曲占据主导地位，三级结构能与已知的2yPa.3(SMTL ID)模型同源建模；存在4个潜在的B细胞表位，位于02-141位的氨基酸区域应答频率最高。利用生物信息学技术分析3CL210的结构和功能特征，可为新型冠状肺炎药物的研发提供参考。
关键词新型冠状病毒(SARS-doV-2)；3CL te；生物信息学；序列分析；蛋白结构
中图分类号Q039.63文献标识码A文章编号1005-7021(2020)06-0044-09
Poi：U.3969/j.issn.1405-7021.6020.46.407
Structuroi and Functionai Charocteristics Analysis of
SARS-CoV-23CL prr vio Bioinformaticc
DAI Zi-wel,TANG Biav
(Med.Schi,Huaao U oc of ChUtesc Mei,Changsha412208)
Abstrrct In this swUp,physicochemical propeDies,structure and function of3-chymotypsin-dae protease(C—) were preVicwV via bioihormatics,to provide references for R&Dof anP-SARS-CoV-2meVicines.Bp preVicting and analyzing the primay structure ol3C—TO such as physicochemical propeDics ol amino acids,hyProphoXic chaycteDs-Pcs preViction analysis in terms ol theoyPcal isoelectric point,half-Ffc periob,fat0(/伍：60and hyPyphoXic chayc-teVstics ol3CLP"on ProtParam,Prothcalo and BioeVit;the structure such as cor/ng spiral reaion on the COILS Server,signal pepPPes on the SignalW,Nansmembranc domain via TMPreV,subcellular location on TarpetP Server,phos-phoyWtion sites and glycosylation sites ol3C—TO on NetPhos Server and NetNGlpe Server；the seconday structure on the SOPMA ,the ter/ay structure ol3CL2y on the SWISS-MODEL,the B cell epitopes ol3CL2y on the IEBD to reai-iec3(2—.3CLP"consists ol326amino acids；among them leacinc accounts for the highest propor/on,moWcoWr weight was33776.64,theoyPcaWsoeWctVc point5.95,haW-Ffe peVob1.9hours,fat0(0伍：6082.12；with relatively high hyPyphiWcitp,containing1Nansmembranc zone,possessing4phosphoyWtWn sites,2glycosylation moPi-fication sites；no chaycteVstic ol coileV spiral reaion and signal pepPPe;random coilc dominate in seconday sNuc-
基金项目：2219年湖南省教育厅科学研究项目优秀青年项目(12B536)；湖南中医药大学“十三五”一级学科基础医学建设项目(No.06)
作者简介：戴姿薇女，本科生o主要研究方向为免疫学基础研究o E-mail：U90129594@qq•cm
*通讯作者o男，博士，硕士生导师o主要研究方向为免疫学基础研究o Tel:9751-C8457291,E-mail：njtangbiao@122.10m 收稿日期：2929W6W8
6期戴姿薇等：新型冠状病毒3C样蛋白酶结构和功能特征分析45
turo,the te/iae structure can be homologops with koowu6yp5.1(SMTL IU)moPei;existing4potexOui B celt epitopes,with the h/hest espoxse freyuexcy ic amiue acid areas at92-41.By aPopOng bioinformatics techuology anapsis ox the structure and fuuctiox of30°coulP provide efeexces for R&D of SARS-CoV2mediciuc.老年人健康码实际使用现状
Keywords Severe acoto espietoe syndrome coroxavirus2(SARS-CoV2)；3O°；bioinformatics;sequexcing；
不良供给
proteic structure
2222年上半年，由新型冠状病毒(Severe uchiv espiwtoe syndema coennviws2,SARS-CoV-4)引起的新型冠状病毒肺炎(Coexo Virus Disensa224,COVIU-4)以数月时间在全世界引起了大流行，对全球居民健康构成了严重威胁。SARS-CoV-2是基因组为单股正链RNA且隶属于0冠状病毒组的新型冠状病毒类型，其结构蛋白主要由刺突蛋白(Spike Protein,S蛋白)、包膜糖蛋白、膜糖蛋白、核衣壳蛋白组成。在SARS-CoV-2入侵宿主时，表面S蛋白被跨膜丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane peteasa se/nes,TMPRSS2)剪切为S1亚基与S2亚基，S1亚基的受体结合区与宿主细胞表面血管紧张素转换酶2(Anomtepsid-Con-ve/ing Enzyma2,ACE2)受体结合引起S2亚基构象变化，形成病毒与细胞膜融合物，从而释放病毒基因组至宿主细胞质中°此后病毒便利用宿主胞内物质合成自身复制所必需的两条复制酶多肽ppln和pplab，同时也开始编码能精确剪切复制酶多肽的剪切酶：木瓜蛋白酶样蛋白酶(papaic-lidv protensa,PL pw)和3C样蛋白酶(3-chymote2-sin-CUa petensa,3CL pe)°PLpra和3CL pw剪切ppln和pplab生成4个成熟非结构蛋白，非结构蛋白参与RNA复制酶-转录酶复合物(rey/case-transc/ptasa complex,RTC)的形成，RTC形成后指导RNA复制和亚基因组RNA的转录，转录成功后，子代基因组与病毒结构蛋白组装为成熟的子代病毒，经胞吐作用释放后感染更多新的细胞［2］°已有研究揭示3CL pe是由两个彼此近似垂直排列的单体组成的二聚体，每个单体包含三个结构域：由0桶状结构组成的结构域I与结构域I，由a螺旋结构组成的结构域皿。其中，两个单体的N端通过与另一个单体上的G1U126位点相互作用来帮助定位底物结合位点S1亚基。目前在3CL pe氨基酸序列公布后，较多研究从已有序列信息结合其结构特点的角度筛选药物靶点：针对3CL pe进行临床试验的蛋白酶类
抑制药物主要为洛皮纳韦和利托那韦，研究证实两者通过抑制CEP_C32的功能可阻止SARS-CoV-2复制周期的进行，以往分子动力学模拟分析也表明两者与SARS-C o V-3CL2W复合物结合亲和力相等，且在药物与复合物形成后分别可检测到6个与7个氢键；槲皮素作为一种中药类药物在毕赤酵母中对SARS-C o V-3CL2W复合物表达的抑制率可达62%，体外酶实验中也表现出对复合物的抑制活性32］。3CL pe在病毒的复制中发挥了重要作用，抑制3CL pe功能能阻断SARS-CoV-4在宿主体内的复制,3CL2W成为了抗SARS-CoV-4药物的重要潜在靶点，但3CL pe的结构和功能特征还有待进一步阐明。本研究结合生物信息学方法，通过利用PetParam、ProtUcaiv；Bioedii服务器对3CL20进行一级结构如氨基酸理化性质、疏水性的预测分析；利用COILS Seear SipnalU TMPred TaryetU See-er、NetPOvs Server、NetUGlye Seear服务器对3CL pe功能结构如卷曲螺旋区、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点的预测分析；利用SOPMA、SWISS-MODEL服务器对3CL pe进行二级结构、三级结构的预测分析；利用IUBD对3CL pe进行B细胞表位的预测分析，为基于3CL po的抗SARS-CoV-4药物研发提供参考。
1材料与方法
11材料
1-1-1数据来源登录美国国家生物信息中心NCBU网站(NCBI网址：http：//bl.nlm. nib.gav/)获取SARS-CoV-43CL pe氨基酸序列信息，并下载其氨基酸FASTA序列(PDB ID：6LU7°
1.1.2主要数据库通过PetParam预测分析3CL pe等电点、半衰期、脂肪系数等理化性质；通过PetUcaiv和Bioedii双重预测分析3CL po疏水性；通过CODS Seear预测分析3CL pe卷曲螺旋区；通过SiynalU预测分析3CL po信号肽；通过TMPed
46微生物学杂志44卷
预测分析3CL po跨膜结构域；通过TaryetP Seear 预测分析3CL po亚细胞定位；通过NetPOvs Seear 预测分析3CL po磷酸化位点；通过NetOGlne Seear 预测分析3CL pe糖基化位点；通过SOPMA预测分析3CL po二级结构；通过SWISS-MODEL同源建模3CL pe三级结构；通过ILBD预测分析3CL2O B细胞表位°
1-2方法
1.2.13CL pe—级结构预测分析通过Pei-Param网页输入3CL pe FASTA格式的氨基酸序列，点击“Compuia parameters）运行结果，呈现3CL pe氨基酸数量、分子质量、理论等电点、正负电荷残基总数、分子式、原子总数、脂肪系数、总平均亲水性等理化性质结果；通过PetUcaiv网页上输入3CL pe FASTA格式的氨基酸序列，选择"Hphob./Kyte&DooXt P e"方法和"Unea/'权重变化模型，点击“SuUmF”运行结果，呈现3CL pe疏水性预测结果；同时运行Bioedk软件，导入序列后点击"Sequence-Protein"，选择"Kyiv&Doolittiv Menn HydephoPicby Profile方法，双重预测3CL po 疏水 性结果320°
1.2.23CL20结构预测分析通过CODS Seear 网页选择默认矩阵MTIDK，分别赋予无权重与有权重选项，输入3CL2W FASTA格式的氨基酸序列，呈现3CL pe卷曲螺旋区预测结果；通过SiynalU网页上选择"EiipFyotvs”训练集,D-cotofO valuvs选择"DOaUP'默认值，MohoP选择"Dipui sepuexcas mup incluUv TM reyions'，以"standarU'模式输出，呈现3CL2e信号肽预测结果；通过TMPred网页上选择17〜33个氨基酸作为跨膜螺旋疏水部分长度后输入3CL2e FASTA格式的氨基酸序列，随即点击“Run TMPed”输出，呈现3CL2e跨膜结构域预测结果；通过TaryetP Seear网页上选择“non-pUFn”的生物类别，以“Lonp0x00）”形式输出，呈现3CL ue亚细胞定位预测结果；通过NetPOvs See-01■网页上选择“Ft thev”的预测范围和“basic”的输出形式，勾选生成图形，呈现3CL hO磷酸化位点预测结果；通过NoNGlyc Seear网页上输入3CL uro FASTA格式的氨基酸序列，选择“Gooaio yophics”，点击“SuUmii'输出，呈现3CL pc糖基化位点预测结果[125]°
1.2.33CL hO高级结构预测分析通过SOPMA 网页输入3CL2O FASTA格式的氨基酸序列，选择"4（Heliv-Sheet,Tuo,Coil）”选项，Simila/tp tOeskolP填入“8”，点击“SUBMIL”输出，呈现3CL ue二级结构预测结果；于SWISS-MODEL网页上输入3CL hO FASTA格式的氨基酸序列后选择“Bu/d ModeP'选项同源建模，选择相似度最高模型输出，呈现3CL ue三级结构预测结果[422]°
1.2.23CL ue B细胞抗原预测分析通过ILBD 网页选择"B Celt Ep/opo Prediction后点击"Pe-dictiop of Unenr eyimpos from protein s—uoco”输入3CL ue FASTA格式的氨基酸序列，选择u Bepipred Lineor Epitopo Prediction”模式输出，呈现3CL2O B细胞表位预测结果[2]°
2结果与分析
2.13CL"。氨基酸理化性质特性分析
利用PetParam服务器在线分析3CL hO氨基酸理化性质，结果如表1所示。3CL hO由306个氨基酸组成，其中亮氨酸（Leu）占比最高，其次为甘氨酸（Gly），没有毗咯赖氨酸（Pyi）和硒代胱氨酸（Sac-；相对分子质量为33796.64，理论等电点值为5.05；正电荷残基数为22个，负电荷残基数为26个；半衰期为1.00不稳定系数为27.65；脂肪系数为62.4°
表13CL”r氨基酸理化性质部分分析结果
TaOic1Part of5CL^physicochemical properties analysis resulis
理化性质数值
氨基酸数目306
分子质量33796264
等电点5295
负电荷残基数（天冬氨酸+谷氨酸）24
正电荷残基数（精氨酸+赖氨酸）22
分子式C1499H2317N455S22原子数目4686风与墙
脂肪系数82.12
氨基酸亲水值总和与氨基酸数量比值-0.04
2.23CL"。氨基酸序列的疏水性分析
蛋白质肽链中残基侧链对溶剂的相对亲水性是一个重要的蛋白质特征参量，且疏水性的变化规律对维系蛋白质超二级结构与三级结构有一定的意义。利用Pethcyiv服务器在线分析3CL hO氨基酸疏水性，结果如图1所示。其中评分最高的
2期戴姿薇等：新型冠状病毒3C 样蛋白酶结构和功能特征分析
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集中于蛋白质的卷曲结构部位，其表面通常富集
亲水性氨基酸，同时也是蛋白质进化过程中氨基 酸插入的主要位点。以上结果表明,31-2/亲水性
较高，且利用BioEdil 双重预测，结果一致（图2）。
为位于第226位的丙氨酸和第207位的氨酸, 均为1.823，表明该位点的氨基酸疏水性最强；评 分最低的为位于96位的脯氨酸，为-1.731，表明
该位点的氨基酸亲水性最强。亲水性区域一般是图1 PrrtScad 预测3CL prr 疏水性
2010年广东高考数学Fig. 1 HyProppobic chaycteDsUcr analysis results of 9CL^ via Proghai
2.3 3CL prr 卷曲螺旋区分析卷曲螺旋是存在于多种天然蛋白质中一类由 2股或2股以上右手a 螺旋相互缠绕而形成的平
行或反平行左手超螺旋结构的总称。利用coil Seter 服务器在线预测30/「。卷曲螺旋结构。本
研究在有权重和无权重的情况下进行分析得知,
31-2「/并未预测到具有卷曲螺旋结构。
2.4 3CL pro 信号肽分析
信号肽是指引导新合成的蛋白质向分泌通路
转移的短肽肽链，位于分泌蛋白的N 端。其由三
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微生物学杂志40卷
5G是把双刃剑个区组成：一个为带负电荷的C 末端，一个为以中 性氨基酸为主的中间疏水序列，一个为带正电的n 末端。中间疏水序列为信号肽的主要功能区,C 末
端为信号序列的加工区。利用SignalW 服务器在线 预测31-2/信号肽区段，结果如图3所示。图3中 C 分值是指剪切位点分值,S 分值表示信号肽分
值,Y 分值表示综合剪切点分值。本次预测结果显 示^CL 10信号肽预测得分较低，剪切位点得分也较
低，因此3CL"。可能不具有信号肽的特点。2.3 3CL po 跨膜结构域分析
跨膜结构域一般由跨膜蛋白组成的效应区域
所展现，跨膜蛋白即跨越膜两端的蛋白质，跨膜部
分形成的a 螺旋或0桶结构对认识蛋白质在细
胞中的定位与作用具有指示意义。利用TMPyV
预测3CL yy 跨膜结构域，得出其有1个跨膜螺旋 区，其位置在163 ~211位，结果如图7所示。
位置
j g n j
分分分阈
图3 SignalP 预测3CL pr 信号肽
Fig. 3 Signal pevtide analysis resulp of 3CL 21D vio SignalW
图4 TMPreC 预测3CL prr 跨膜结构域
Fig. 4 Trapsmembraac Pomaia analysis results of 3(2—° via
147rt
SignalW
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