1、下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。 六书通资料1：巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]。
资料2：巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染体发生同源重组，将目的基因整合于染体中以实现表达。 资料3：限制酶酶切位点
限制酶 | SnaB Ⅰ | Avr Ⅱ | Sac Ⅰ | Bgl Ⅱ |
识别序列及酶切位点 | | | | 网络流量测试 |
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（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上______、______限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用__________将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 。
（3）步骤3中应选用限制酶______来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡那霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用__________方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入______以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比，用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行 并分泌到细胞外，便于提取。
2、凝乳酶是奶酪生产中的关键性酶。直接利用动、植物生产凝乳酶受多种因素限制，培育高酶活力凝乳酶微生物菌种是目前最有前途的发展方向。从牛胃液中分离到的凝乳酶以催化能力强而被广泛应用，研究人员运用基因工程技术，将编码该酶的基因转移到了微生物细胞中。 （1）从牛胃细胞中提取 ，再逆转录形成 cDNA，以此 cDNA 为模板 PCR 扩增目的基因，有时需要在引物的5’端设计 （填“限制酶”“DNA 连接酶”或“RNA 聚合酶”）识别
序列，以便构建重组 DNA 分子。
（2）构建重组 DNA 分子（如图 1 所示）最好选用 限制酶，理由是 香山帮。若研究人员获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组质粒，如图 2 所示。这三种重组质粒中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是 。
（3）工业化生产过程中，最初多采用重组大肠杆菌或芽孢杆菌生产凝乳酶，现多采用重组毛霉生产，相较于大肠杆菌，毛霉作为受体细胞的优势是 。
（4）研究发现，如果将该凝乳酶的第 20 位和第 24 位氨基酸改变为半胱氨酸，其催化能力将提高2 倍。通过蛋白质工程生产高效凝乳酶，所需步骤有 。
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a．蛋白质的结构设计 b．蛋白质的结构和功能分析 c．蛋白质结构的定向改造d．凝乳酶基因的定向改造 e．将改造后的凝乳酶基因导入受体细胞f．将定向改造的凝乳酶导入受体细胞
3、人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的部分过程，图中Tetr 表示四环素抗性基因，Ampr 表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题：
限制酶 | Ⅰ | Ⅲ | Ⅰ | Ⅰ | Ⅰ |
识别序列及切割位点 | | | 张楚汉 | 多血症 | |
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（1）要获得人乳铁蛋白基因，一般是通过__________文库获取，该过程是用人体发育的某个时期的mRNA经__________产生的。利用PCR 技术扩增人乳铁蛋白基因时，需要加入的酶是__________，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，55～60℃有利于____________结合到互补DNA 链上。
（2）一个基因表达载体的组成必须有复制原点、启动子、终止子、_________、__________等。若选用牛作为转基因动物可将人乳铁蛋白基因与__________的启动子等调控组件重组在一起，可通过__________方法将基因表达载体导入受精卵中，然后使其发育成转基因动物。
（3）据图分析，筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含____________________（填“四环素”“氨苄青霉素”或“四环素或氨苄青霉素”）的培养基上进行，原因是
。
（4）要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是________________，若要检测转基因动物DNA 上是否插入了目的基因，检测方法是_______ 。
4、核衣壳蛋白（N蛋白）是RNA病毒的主要结构蛋白，与其致病性密切相关。新型冠状病毒（SARS-CoV-2）作为一个新的RNA病毒变种，属于冠状病毒属。自新冠爆发以来，不同地区出现了多种变异毒株，目前研究发现，不同的SARS-CoV-2的N蛋白几乎没有差异，
但与其他冠状病毒N蛋白存在序列上的很多变异。以下为某研究团队借助现代生物技术构建SARS-CoV-2的重组N蛋白用于抗体检测和其他研究的过程。请分析回答：
（1）分析发现SARS-CoV-2N蛋白在其肽链的C端和N端与其他冠状病毒N蛋白间存在变异，为得到相应目的基因必须对现有N蛋白进行 ，方法是通过相应的生物学技术预测分析SARS-CoV-2N蛋白的结构，并利用氨基酸分析技术得到其氨基酸序列，再利用 推测控制合成SARS-CoV-2N蛋白的核苷酸序列，进而得到相应的目的基因（DNA）序列，以上步骤为____________的技术环节，属于第二代基因工程技术。
（2）合成SARS-CoV-2的N蛋白基因的具体方法为：先通过____________过程得到SARS-CoV-2的cDNA，再通过设计特定的___________，采用___________技术扩增冠状病毒N蛋白基因。
（3）在接下来的基因工程中最核心的步骤是 ，该过程中，他们选用了pET-28质粒（如下图1），其上所含的限制酶的识别和酶切位点如图2，为使上述方法获得的目的基因能准确插入pET-28质粒，可在设计两种___________时，分别在其_________
__端加上 、 （按从左向右5′→3′顺序书写序列）
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