生物技术制药复习知识点
第一章 绪论
1.生物制药的研究内容包括基因工程制药，细胞工程制药，酶工程制药和发酵工程制药。 2.生物技术制药，是采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物，是采用 DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、性抗体或核酸类药物。 4.生物药物，指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分，甚至整个生物体用作诊断和的医药品。
5.现代生物药物四种类型：①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类剂。②基因药物，如基因剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。③来自动植物和微生物的天然生物药物。④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类：药物，预防药物和诊断药物。
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7.生物技术药物的特性：分子结构复杂，具种属特异性，针对性强、疗效高，稳定性差，基因稳定性，免疫原性、重复给药会产生抗体，体内半衰期短，受体效应，多效性和网络效应，质量控制的特殊性，生产系统的复杂性。
人体名称妙喻8.生物技术制药特征：高技术，高投入，长周期，高风险，高收益。
9.基因诊断：指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章 基因工程制药
1.利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进
行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
2.基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
3.基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的获得，构建DNA重组体，构建基因工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验和产品包装等。
4.对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。
5.目的基因获得的方法：反转录法，化学合成法，逆转录-聚合酶链反应法和改造现有基因。
6.基因表达：结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
7.对于宿主细胞其应该满足的条件：
容易获得较高浓度的细胞；
能利用易得廉价原料；
不致病、不产生内毒素；
发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；
容易进行代谢调控；
容易进行DNA重组技术操作；
产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。
8.原核细胞大肠杆菌中的表达的特点：
①不存在信号肽，产品多为胞内产物；
②分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包涵体，产物须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性；
③不存在翻译后修饰作用（故只能表达翻译后修饰对其生物功能并非必须的真核蛋白质）；
④翻译通常从甲硫氨酸的AUG密码子开始，故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应；
⑤产生的内毒素难以除去；
⑥ 产生的蛋白质酶会破坏蛋白质。
9.真核细胞酵母特点：
①真核生物细胞，有翻译后加工过程；
②基因组小，仅为大肠杆菌的4倍；
③ 世代时间短，有单倍体和双倍体两种形式；
⑤基因操作与原核生物相似；
⑥可以建立有分泌功能的表达系统，将产物分泌出胞外，分离纯化工艺相对简单；
⑦ 表达产物能糖基化。
马克思劳动价值论10.真核基因在原核细胞中表达，其表达载体必须具备如下条件：（1）载体能独立地进行复制；（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记；（3）应具有很强的启动子；（4）应具有阻遏子；（5）应具有很强的终止子；（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号。
11.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？
答：（1）外源基因的拷贝数:与载体在宿主中的拷贝数及稳定性直接相关。
（2）外源基因的表达效率
影响因素；
启动子的强度；
核糖体结合位点的有效性；
SD序列和起始密码ATG的间距；
密码子的组成等。
12.真核基因在大肠杆菌中的表达形式有融合蛋白的形式，非融合蛋白的形式和分泌型表达蛋白药物基因。
13.质粒不稳定性分为分裂不稳定和结构不稳定。
14.提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌，选择合适的载体，选择压力，分阶段控制培养，控制培养条件，固定化。
15.高密度发酵：一般指培养液中工程菌的菌体浓度在50 g干重/L以上，理论上的最高值可达到200 g干重/L。
16.实现高密度发酵的方法：①改进发酵条件（补料分批发酵）。②构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（控制溶氧饱和度的滞后性）。③构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌（可溶性或分泌形式表达的目的蛋白而言）。
17.基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤， 包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。
18.包含体形成的原因： 高水平表达的结果和缺乏帮助蛋白折叠的酶和分子伴侣。
19.包含体蛋白复性方法：透析或稀释复性法；含有二硫键蛋白的复性；封闭蛋白的疏水簇促进复性；小分子添加剂促进复性；添加分子伴侣或折叠酶促进复性。
第三章 动物细胞工程制药
1.离体培养细胞分三类：贴壁细胞，悬浮细胞和兼性贴壁细胞。
2.动物细胞的生理特点：①细胞的分裂周期长；②细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象；③正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；④动物细胞对周围环境十分敏感；⑤动物细胞对培养基要求高；⑥动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。
3.动物细胞生产药物的优缺点有哪些呢？
答：缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点：分泌胞外、纯化方便；翻译后修饰，特别是糖基化较完善，与天然产品一致，适合于临床使用。
4.目前应用于生物制药领域的动物细胞包括原代细胞，二倍体细胞系，转化细胞系和工程
细胞系。
5.转染，外源DNA掺入真核细胞的过程。分为瞬时转染和稳定转染。
6.常用的转染方法有化学法（脂质体法，磷酸钙法，阳离子聚合物法，DEAE—葡聚糖法），病毒法（反转录病毒，腺病毒）和物理法（基因法，显微注射法和电穿孔法）
7.细胞库分三级管理，即1）原始细胞库（PCB）：由原始细胞体发展成传代稳定的细胞体，或经过克隆培养而形成的均一细胞体。2）主细胞库（MCB）：由原始细胞库细胞经过传代、增殖后均匀混合，定量分装形成的。3）工作细胞库（WCB）：由主细胞库细胞传代扩增制成。
8.器具的清洗包括浸泡，刷洗，泡酸／碱和冲洗四步。
9.动物细胞常用的灭菌方法包括干热和湿热灭菌，常用的除菌方法是使用0.22μm的微孔滤膜进行无菌过滤。陈中浙
10.哺乳动物细胞最佳温度为37±0.5℃，昆虫细胞则为27℃。温度过高可引起细胞退变甚至死亡，过低会降低其代谢和生长速度，影响产物的产量。
11.动物细胞培养基中每增加或减少1mg/ml的NaCl可使培养基的渗透压增加或减少32mOsm/kg。
12.动物细胞培养基的大致可分为4类：天然培养基、合成培养基、无血清培养基和化学限定性培养基。
天然培养基：由化学成分不完全清楚的天然物质配制而成的培养基。
合成培养基：由化学成分已知的营养物质配制而成的培养基。
无血清培养基：即不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
无蛋白培养基：无蛋白培养基即不含有动物蛋白的培养基。
化学限定性培养基：是指培养基中的所有成分都是明确的。
13.无血清培养基的优点：①提高细胞培养的可重复性，避免由于血清批次间差异的影响；②减少血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染；③供应充足稳定；④产品易纯化；
⑤避免血清中某些因素对细胞的毒性；⑥减少血清中蛋白对生物测定的干扰。
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14.比较动物细胞悬浮培养和贴壁培养的区别，各自存在哪些优缺点？北京scc
答：①悬浮培养：让细胞自由的悬浮于培养基内生长繁殖。适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优势：传代时不需要胰酶消化，操作简便、培养条件均一，传质和传氧较好，容易大规模培养，可借鉴细菌发酵经验。不足：不适于灌流式培养，细胞密度低。
②贴壁培养：让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。适用于一切贴壁细胞，也适用于兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞种类广，容易采用灌流培养方式使细胞达到高密度。缺点：操作麻烦，需要合适的贴附材料和足够面积，培养条件不均一，传质和传氧较差，因此难以扩大培养。与悬浮培养不同，在传代和扩大培养时常常需要用酶将其从基质上消化下来，分离成单个细胞后进行培养。
15.比较动物细胞批式操作，流加式操作和灌流式操作的区别，各自存在哪些优缺点。
答：①批式操作，特点：培养过程中不进行营养物的流加，一次性收获。优点：操作简单
、易于控制、培养周期短、污染的风险低。缺点：产物的产量低。
②流加式操作，特点：培养过程中流加浓缩的营养物或培养基，一次性收获。优点：细胞持续生长至较高密度，目标产物达到较高水平。缺点：需要保证葡萄糖和谷氨酰胺浓度足够维持细胞生长需要又不至于产生大量的副产物。
③灌流式操作，特点：不断补充新鲜培养基，同时采用细胞截留装置以相同流速不断地流出培养液。优点：有害代谢废物浓度低，可极大提高细胞密度和产品产量，可及时收获产品，有利于产品质量的提高。缺点：消耗大量培养基，营养成分利用率低；下游处理负担增加，生产成本增加；培养周期长，污染的概率增加；长期培养可能影响产品的稳定性。
第四章 抗体制药
1. 抗体， 也叫免疫球蛋白 (Ig)，是一种能特异性结合抗原的糖蛋白，而抗原是在易感染动物体内引发抗体产生的物质。
2.抗体是由两条重链和两条轻链组成的异源二聚体蛋白。抗体以一个或者多个 Y 字形单体存在。Y 字形结构的顶端是可变区，为抗原结合部位。
3.抗体的多样性主要表现在以下方面。
答：①轻重链可变区V(D)J基因重排，②连接多样性，③轻重链的随机组合，④体细胞高频突变，⑤体细胞基因转换，⑥受体编辑。
4.单克隆抗体，仅识别单一抗原表位的B细胞杂交瘤产生的同源抗体。制备过程：用目的抗原刺激B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞杂交，选择性培养，杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化，单克隆抗体的大量制备。
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