DOI：10.3969/j.issn.l674-2591.2021.02.013
•综述・
亢进症的表观遗传学
杨奕，王鸥
［摘要］多发性内分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type1,MEN-1)是一种常染体显性遗传性疾病，主要临床表现为原发性甲状旁腺功能亢进症、垂体前叶肿瘤或增生、胃肠胰腺神经内分泌肿瘤等。 表观遗传学水平的变化已被证实在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，而MEN-1相关内分泌肿瘤的表观遗传学机制研究尚不多见。本文就表观遗传学参与MEN-1相关甲状旁腺功能亢进症发生、发展的机制研究进展进行综述。
［关键词］多发性内分泌腺瘤病1型；原发性甲状旁腺功能亢进症；表观遗传学
中图分类号：R582文献标志码：A
Epigenetic mechanism of multiple endocrine neoplasia type1
related primary hyperparathyroidism
YANG Yi,WANG Ou
Department of Endocrinology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Key Laboratory of Endocrinology of National Health Commission of
the People's Republic of China,Beijing100730,China
[Abstract]Multiple endocrine neoplasia type1(MEN-1)is an autosomal dominant genetic disorder,whose main clinical manifestations are primary hyperparathyroidism，anterior pituitary tumor or hyperplasia，gastrointestinal and pancreatic neuroendocrine tumor.Epigenetic alterations have been proved to play important roles in the development of a wide range of tumors，while epigenetic mechanisms of MEN-1-related endocrine tumors have not been well understood.
This article aims to review the epigenetic mechanism in the pathogenesis and development of MEN-1related hyperparathyroidism.
[Key words]multiple endocrine neoplasia type1；primary hyperparathyroidism；epigenetics
多发性内分泌腺瘤病1型(multiple endocrine neoplasia type1,MEN-1)又称Wermer综合征，属于常染体显性遗传性疾病，主要表现为原发性甲状旁腺功能亢进(primary hyperparathyroidism，PHPT)、垂体前叶肿瘤或增生、胃肠胰腺神经内分泌肿瘤，以及面部血管纤维瘤、胶原瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、脑膜瘤和室管膜瘤等非神经内分泌肿瘤。其中，PHPT是MEN-1最常见的表现,
基金项目：中国医学科学院医学与健康创新工程：内分泌肿瘤基础与临床研究(CAMS-I2M)2017-I2M-1-001
作者单位：100730北京，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科国家卫生和健康委员会内分泌重点实验室
通信作者：王鸥，E-mail:wang_ou2010@126
其甲状旁腺主要的病理改变为甲状旁腺增生、腺瘤或腺癌。
目前研究发现，11号染体长臂(11q13)上的MEN-1基因突变与MEN-1的发病有关。MEN1作为抑癌基因，其杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)导致的11q13位置上正常MEN1双等位基因缺失或失活是导致MEN-1相关肿瘤的原因。MEN1编码的menin蛋白是一个67kd的核蛋白，是一种肿瘤抑制因子 而不具酶活性。Menin的分子构型表现为一个深口袋结构，可以作为相互作用蛋白质的结合点［1］。在黑腹果蝇中进行的研究表明menin在维持基因组稳定性方面发挥作用［2］，而蛋白质一蛋白质相互作用研究的证据表明，menin也可以通过与染质相关蛋白复合物和转录因子中的蛋白质相互作用参与表观遗传调控和基因转录，影响包括调控细胞增殖的基因在内的一些靶基因的表达。 虽然普遍认为DNA水平的遗传改变在肿瘤发生发展中具有关键作用，但表观遗传变异也同样参与了肿瘤的发生发展。一项大样本的肿瘤相关基因组测序项目发现，大约50%的肿瘤患者体内存在染质蛋白质修饰情况的改变，同时恶性肿瘤细胞还表现出全基因组DNA甲基化、染质结构和调控元件活性的改变［3］。
表观遗传学研究的是稳定的遗传修饰性作用，这些修饰在不改变DNA序列的情况下，对核小体进行重塑，改变其形态和功能，从而使得基因组在不同的生长发育时期、组织器官类型、病理状态下有不同的表达。对于有关DNA转录的调控因素(如转录因子基因表达)而言，染质的修饰是必不可少的。染质组成成分的修饰如DNA修饰及组蛋白翻译后修饰可以和非编码RNA对染质的修饰共同作用于基因表达的调节。DNA和组蛋白修饰的改变、染质重塑和非编码RNA相互作用的改变，产生了影响基因转录和染质结构的不同环境。此外，染质之间可以在短距离或长距离的范围内产生相互作用的性质，也能够增强基因转录或隔绝基因转录区域，表现出转录调控作用。鉴于表观遗传修饰改变的可逆性和可控性，为疾病早期防治提供了新策略和潜在的靶点，因此表观遗传学研究日益受到重视。
而在MEN-1相关内分泌肿瘤方面，表观遗传学机制在其发生发展中的作用研究尚不多见，本文拟就表观遗传学参与MEN-1相关甲状旁腺功能亢进症发生、发展中的机制研究进展进行综述。
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DNA甲基化是表观遗传修饰研究最多的机制之一，它通常与基因沉默有关。DNA甲基化是一种主要发生在CpG位点的表观遗传修饰。CpG位点(CpG site,GC-rich DNA site)的甲基化通常位于基因的启动子区，这些启动子区CpG位点异常低甲基化或超甲基化分别可导致基因过度表达或基因沉默。由DNA甲基转移酶(DNA methyl transferases,DNMTs)家族介导CpG甲基化，包括DNMT1，DNMT3A和DNMT3B等。
多项研究证明与肿瘤相关的DNA甲基化改变通常发生在相关基因的启动子区，研究显示在甲状旁腺肿瘤中基因启动子区的甲基化水平异常可能通过参与细胞周期的调控发挥作用。遗传性MEN-1肿瘤或散发性甲状旁腺肿瘤中，存在着不同基因(APC⑷，CDKN2B/p15［5］,HIC1［6］, MEG3［7］和RIZ1［8］等)表达的降低以及这些基因启动子区部分DNA的超甲基化。De Paoli-Iseppi 等［9］对54个手术切除的甲状旁腺腺瘤样本和8个正常甲状旁腺样本进行了DNA提取和重亚硫酸盐法检测MEN1基因启动子区甲基化水平，发现相对于正常甲状旁腺组织，甲状旁腺腺瘤组织中的MEN1启动子区CpG位点1-23的甲基化水平较低，而位点24-39的甲基化水平较高；而在甲状旁腺腺瘤中，来源于临床诊断ME
N-1患者的甲状旁腺腺瘤的MEN1启动子区CpG位点25、27和28的甲基化水平明显高于散发性原发性甲旁亢的病人样本，位点26、29-33的甲基化水平也偏高。Carling等冈研究了甲状旁腺肿瘤中RIZ1基因的表达水平和启动子甲基化，在47例取自散发性原发性甲状旁腺功能亢进病人的甲状旁腺腺瘤组织中，有13例RIZ1存在杂合性缺失，而且在存在杂合性缺失的样本中，咼达89%的甲状旁腺肿瘤中检测到RIZ1基因启动子区域的高甲基化。
Juhilin等［4］进行了另一项有关甲状旁腺肿瘤组织的APC基因甲基化的研究，在55个肿瘤组织样本中，有39例标本中APC基因1A启动子区存在密度超过10%的高甲基化状态(正常甲状旁腺组织APC启动子区甲基化水平极低，约2.2%~ 4.0%)。在MEN-1可能累及的其他内分泌腺体的肿瘤中，也发现了DNA甲基化的异常。Zhao 等［7］在研究中发现MEG3在正常人类垂体细胞中呈高表达，而在无功能垂体腺瘤中没有检测到MEG3的表达产物，应用重硫酸盐法处理正常垂体组织和垂体无功能腺瘤组织，发现在无功能腺瘤组织中MEG3的1号外显子上游2.1kb的启动 子区的首尾各约500bp的两区域有明显的CpG岛过甲基化的表现，而用DNMT1抑制剂地西他滨处理MCF7细胞后，MCF7细胞中可发现明显的MEG3表达，证明MEG3调控区域过甲基化导致MEG3表达缺失是无功能垂体瘤发生的重要机制。在另一项研究中,Lindeberg等［5］对16例胰腺神经内分泌肿瘤患者组织进行定量RT-PCR研究，发现10例肿瘤组织CDKN2B mRNA的水平略高于正常胰腺组织，而其中2个标本中检测到CDKN2B启动子区50%的CpG过甲基化，其他6个胰腺神经内分泌肿瘤组织以及正常胰腺组织均未检测到DNA的
异常甲基化，这提示了CDKN2B 启动子区异常甲基化在胰腺神经内分泌肿瘤发生中可能具有一定作用。
同时，Juhlin等［4］在另一项有关长散在重复序列-1(long interspersed nuclear elements-1，LINE-1)的研究中，发现在甲状旁腺肿瘤和正常的甲状旁腺组织中，全启动子甲基化的水平相似(平均70%)；相较于人类其他大多数肿瘤类型，甲状旁腺肿瘤并没有整体甲基化水平降低的特点。尽管如此，Starker等［10］的全基因组甲基化分析发现，与正常甲状旁腺组织相比，甲状旁腺腺瘤中存在包括CDKN2B、RAMP1、KCTD1、SEMA3F、SOCS3等在内的367个基因甲基化水平明显改变，而甲状旁腺癌和正常甲状旁腺组织相比，存在LYPD3、HIST1HEJ、HOXC11、SFRP1、DGKI等 175个基因的甲基化水平明显不同；相较于甲状旁腺癌，甲状旁腺腺瘤中CDKN2A、LYPD3、CLDN6、SOCS2、HOXA9等263个基因表现出明显不同的甲基化水平。有研究提示MEN-1相关甲状旁腺腺瘤组织中的甲基化水平异常与DNMT1表达量增加有关。Yuan等［11］利用结合连接介导PCR富集HpaII微小片段(HpaII tiny fragment enrichment by ligation-mediated PCR,HELP)标记和大规模并行处理机，对分布在整个基因组的大约200万个CCGG位点的CpG甲基化状态进行检测，结果显示在甲状旁腺腺瘤和甲状旁腺癌中，呈现出明显高甲基化位点的数量分别有48162个和27169个，而在MEN-1相关甲状旁腺腺瘤中高达466950个位点表现为高甲基化，其中有275340个位点位于启动子区。在这些MEN-1相关甲状旁腺腺瘤组织的高甲基化位点中，167988个位点显著高甲基化，其中的3772个位点
位于肿瘤抑制基因区域。这些发现提示MEN-1相关甲状旁腺肿瘤中DNA甲基化水平升高是一个全基因组事件［11］。同时，在野生型小鼠MEN1细胞系中, menin的敲除可在不影响DNMT3A和DNMT3B转录水平的同时上调DNMT1的表达和活性，而诱导menin表达的质粒则导致DNMT1的表达和活性下调。在体外的MEN1-WT细胞系以及MEN-1缺失细胞系中，结果也是一致的。这些结果提示MEN-1相关甲状旁腺肿瘤中，menin的表达缺失可使基因的启动子区甲基化水平增高，而启动子区甲基化水平的普遍升高则是DNMT1表达水平和活性程度提高的结果［11］。
上述研究提示，无论是散发还是MEN-1相关甲状旁腺中均存在基因或基因组DNA甲基化的改变，而MEN-1相关甲状旁腺腺瘤中存在全基因组(包括肿瘤抑制基因区域)DNA甲基化水平的增高，可能是通过DNMTs表达水平的改变导致。e. coli
非编码RNA调控
非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)缺少开放阅读框(open reading frames，ORFs)，不编码蛋白质。短小的非编码RNA如微小RNA (micro-RNA,miRNA)由较长的原始转录物转化成为小的单链分子。它们通过碱基互补配对原则结合染质中DNA的特定位点，进而影响转录复
合体，实现RNA介导的基因沉默，或者通过降解或阻断mRNA阻止翻译的进行［12］o长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)是200bp 或更长的转录本，可以与DNA或蛋白质相互作用，
从而参与表观遗传调控［13］。对非编码RNA 的高通量分析发现，超过50%的miRNA基因聚集在一起形成miRNA簇，而非均匀分布在染体上，但这种非随机分布的机制仍不清楚。此外，在计算机分析中表明，当预测的靶点富集到癌相关基因时，集中miRNA的相互联系作用更加频繁，这表明miRNA簇在调控基因网络方面更加有效。
在内分泌相关细胞系模型的研究中，Luzi 等［14］通过Target Scan预测软件进行生物信息学搜索，发现了以MEN1mRNA3'UTR为作用靶点的microRNA-24-1(miR-24-1)，并利用荧光素酶报告基因检测了miR-24-1的作用，发现miR-24-1与MEN1mRNA3'UTR的结合会降低后者的功能，导致menin表达水平降低，参与MEN-1相关内分泌肿瘤的发生。同时，同一团队对2例正常甲状旁腺组织、2例散发性甲状旁腺腺瘤组织和7例MEN-1相关甲状旁腺肿瘤组织进行miR-24表达的比较，结果显示成熟的miR-24-1只在保留有野生型MEN1等位基因的MEN-1甲状旁腺腺瘤组织中表达，而在存在MEN1-LOH的MEN-1相关甲状旁腺腺瘤组织和散发性甲状旁腺腺瘤中都没有表达。该团队进一步使用menin的多克隆抗体和抗IgG抗体，对来自MEN-1患者的甲状旁腺肿瘤组织进行染质免疫沉淀蛋白检测，并利用包含miR-24-1启动子区的RT-PCR方法对共沉淀的DNA进行扩增并分析，与存在LOH的MEN-1甲状旁腺腺瘤组织和沉淀IgG的MEN1甲状旁腺腺瘤组织相比，只有不存在LOH的MEN-1(即仍存在一个野生型MEN1等位基因拷贝)相关甲状旁腺腺瘤组织中存在miR-24-1启动子。这些结果表明，menin通过识别、结合miR-24-1基因启动子诱导其表达。由于menin是miR-24-1的正向调节因子，而miR-24-1对me
nin的表达起负性调节作用，推测在缺乏LOH的MEN-1相关甲状旁腺腺瘤组织中，menin与miR-24-1通过形成"负反馈环”的方式，通过表观遗传学方式参与肿瘤发生［14］。另一个团队先通过检索microCosm Targets 等5个生物信息学数据库发现了hsa-miR-24、hsa-miR-28、hsa-miR-326、hsa-miR-484、hsa-miR-637和hsa-miR-744等6种可以与MEN1mRNA3'UTR 区结合的miRNA，之后他们对56例手术切除的原发性甲旁亢患者的甲状旁腺组织标本提取了DNA和总RNA，进行了MEN1基因测序和基于定量RT-PCR的miRNA表达量分析，发现在存在MEN1基因突变的甲状旁腺腺瘤细胞中，hsa-miR-24和hsa-miR-28的表达量明显低于不存在MEN1突变的散发性甲状旁腺腺瘤［15］。这一结果也印证了menin与miRNA的相互调节在甲状旁腺肿瘤发生过程中的可能作用。
在另一项研究中，Luzi团队发现在甲状旁腺肿瘤中，除miR-24外，还有如miR-4258等其他的miRNA表达受到menin水平的影响。Luzi等［16］对不同来源和基因特征的甲状旁腺腺瘤组织进行定量RT-PCR和miRNA微阵列分析，发现在存在LOH 的MEN-1甲状旁腺腺瘤和缺乏LOH的MEN-1甲状旁腺腺瘤之间，hsa-miR-485-5p、hsa-miR-1261、hsa-miR-135b、hsa-miR-3944、hsa-miR-1301、hsa-miR-4258等6种miRNA有显著表达差异。其中, miR-4258在缺乏LOH的MEN-1甲状旁腺腺瘤组中的表达水平是散发甲状旁腺腺瘤组的2.35倍，但同时其在存在LOH的MEN-1甲状旁腺腺瘤中表达水平仅为LOH缺乏组的0.48倍，这显示miR-4258的表达需要至少一个野生型MEN1等位基因存在。这些差异化表达的miRNA提示它们或与miR-24-1一样，需要menin的存在才能表达。进一步利用特异性针对MEN
1的siRNA转染BON-1细胞，发现MEN1mRNA的沉默导致前miR-4258的下调，证实了miR-4258的表达受MEN1表达控制这一假设［16］。
有研究显示非编码RNA在其他MEN-1可能累及的内分泌腺体中也参与了肿瘤的发生。Modali等人发现，在MIN6小鼠胰岛素瘤细胞系中,MEG3lncRNA高表达的细胞系经过6d培养后，其增殖程度明显低于对照组；经流式荧光细胞分选后发现，处于G0/G1期的细胞比例显著低
于MEG3lncRNA低表达组的同时，处于G2/M期的细胞比例明显较高［17］。微阵列基因表达分析结果显示，MEG3lncRNA高表达组的细胞中，包括与人类多种肿瘤发生相关的原癌基因基因MET在内的36个基因表达有不同程度的下调，同时通过DAVID数据库进行基因功能分类发现，相较于MEG3lncRNA低表达组细胞，高表达组细胞中存在明显的与细胞黏附、凋亡相关基因的富集［17］。
上述有关MEN-1相关内分泌器官的研究提示，MEN-1相关的肿瘤发生在受到特定基因突变以及甲基化水平改变影响的同时，一些非编码RNA与相关基因以及其产物之间可能存在反馈调节，通过影响细胞周期参与肿瘤的发生。2010年诺贝尔化学奖
组蛋白甲基化修饰
组蛋白是染质的主要蛋白质组分，作为DNA缠绕的线轴，和DNA共同组成核小体结构。组蛋白的氨
基末端由20-35个氨基酸残基组成，具有高度的保守序列，易受诸如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP核糖基化等修饰，这些表观遗传学修饰在大多数情况下都是可逆的。组蛋白在染质结构域的建立和如转录、复制、修复和染体凝聚的调节中发挥作用，其中受研究最多的是组蛋白的甲基化［18］。组蛋白甲基化发生在赖氨酸和精氨酸残基上，每个残基可以包含一到三个甲基，发生在不同组蛋白上的不同程度的甲基化提示不同的基因活跃度，如发生在组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)、H3K36和H3K79上的甲基化通常与基因活跃表达相关，而H3K9、H3K27、H4K20上的双甲基化和三甲基化则提示基因沉寂［18］。徐州东方集团
目前尚未发现与MEN-1相关PHPT有关联的组蛋白修饰结果，但在MEN-1相关胰腺神经内分泌肿瘤中，研究人员利用基因微阵列技术检测胰岛样生长细胞，发现对比野生型胰岛样生长细胞，在MEN-1敲除组中表达量下降20%以上的基因里，绝大部分表现出了H3K4me3的显著下降，提示menin对转录活性增强的H3K3me3有促进作用［19］。另一项研究通过向不同年龄的C57BL小鼠胰岛细胞中转染表达野生型及突变型menin的质粒，利用RT-PCR、Western blot和免疫沉淀技术观察到表达突变型menin的细胞中，CDKIp18和CDKIp27的表达在18周龄和40周龄的小鼠细胞中都有明显的下降，进一步的染质免疫沉淀显示，MEN-1敲除的小鼠胰岛细胞中p18和p27的的启动子区域H3K4甲基化程度减少，提示menin可能是通过与p18和p27的启动子结合，使该部位H3K4位甲基化程度增加，从而维持p18和p27的活性，最终导致胰岛细胞肿瘤的发生［20］。Lin等采用染质免疫沉淀结合二代测序
方法观察小鼠胰岛细胞瘤组织中H3K4me3信号通路中相关基因的表达，发现在MEN-1敲除的小鼠中，肿瘤组织H3K4me3表达下降伴随着H3K27me3表达的显著增加［21］。
总结
表观遗传学是近年来肿瘤预防与的的研究方向之一。借助分子生物学的进展，增加了对于内分泌肿瘤特别是MEN-1相关PHPT的发病机制的认识。目前有限的研究发现MEN-1相关甲状旁腺肿瘤的表观遗传修饰可发生在相关肿瘤发生基因的启动子甲基化、miRNA与靶蛋白互作、组蛋白甲基化水平变化等不同层次，最终细胞周期的变化，导致肿瘤的发生。表观遗传修饰调节物质，如组蛋白甲基转移酶抑制剂DZNeP，也有通过逆转性干预肿瘤发生发展的可能，从而对临床上MEN-1相关甲状旁腺肿瘤的预防和发挥作用。
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