朱锡;易伟
卡玛斯大货车【摘 要】国际单位制
目的 用T7噬菌体展示技术(phage-displayed technique,PDT)筛选与可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,sLRIG1)相互作用的蛋白,为进一步研究sLRIG1作用于人脑胶质瘤的机制到突破点.方法 利用BacPAK6杆状病毒蛋白表达系统(baculovirus expression system,BEVS)获得人sLRIG1重组蛋白,以该蛋白为靶标,采用亲和淘洗方法经6轮筛选人肝细胞cDNA T7噬菌体展示文库;随机挑选96个筛选到的噬菌体行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段并送测序.结果 经过6轮筛选,噬菌体投入和产出量比达1.85×106 PFU,趋于稳定.回收的DNA片段多在250～750bp,纯化回收后得到35个克隆样本,送测序后得到35条有效表达序列标签,对其行同源性搜索及功能预测等生物信息学分析,最终获得12个可能与sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽,这些蛋白大多与肿瘤相关.结论 通过PDT可获得与sLRIG1蛋白相互结合的蛋白,这些结果为下一步研究sLRIG1的生物功能及其对人脑胶质瘤的作用及机制奠定了基础. 【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2018(047)011
【总页数】dormicum3页(P49-51)
【关键词】T7噬菌体;可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1;胶质瘤;相互作用蛋白
【作 者】朱锡;易伟
【作者单位】430079 武汉,湖北省肿瘤医院;430060武汉大学人民医院
【正文语种】中 文
【中图分类】R3
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可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(soluble leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1, sLRIG1)是多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)的胞外段。先前研究表明LRIG1是多个酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase, RTK)的内源性抑制因子，在人类脑胶质瘤或其他肿瘤中具有广泛的前景[1]。sLRIG1可识别并结合这些受体的胞外段，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)[
2]。然而，Xu等[3]通过蛋白晶体实验对sLRIG1与EGFR的结合和作用提出了疑问。目前对于sLRIG1或LRIG1的生理作用机制仍然知之甚少，甚至sLRIG1或LRIG1与多RTK是否直接结合，都有待进一步研究。因此，筛选出与LRIG1或sLRIG1直接结合的蛋白至关重要。T7噬菌体展示技术(phage-displayed technique, PDT)是筛查与靶蛋白亲和力高、有可能直接结合的蛋白的有效方法。本研究以靶蛋白(sLRIG1)为诱饵，通过PDT技术，经过结合、洗脱、扩增3个步骤，筛选噬菌体Complementary DNA(cDNA)文库，从而获得与靶蛋白相互作用的蛋白。
材料与方法
1.材料：重组sLRIG1蛋白，为课题组前期使用杆状病毒表达系统制备，蛋白浓度160μg/ml、纯度95%以上，SDS-PAGE和免疫印迹鉴定正确[4]。T7肝细胞cDNA文库和BLT5615购自美国Novagen公司。DNA聚合酶Extag购自宝生物(日本TaKaRa)公司。ELISA酶标板购自美国Dynatech公司。Brandford蛋白浓度检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术研究所。ECL超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司。DNA marker购自武汉天源生物技术公司(Ruibio分装)。琼脂糖凝胶DNA快速纯化回收试剂盒购自原平皓生物技术有限公司。
2.ELISA酶标板的sLRIG1蛋白包被:用去离子水250μl轻轻清洗ELISA酶标板5次，每次5min，轻拍去除水分。1×TBS稀释重组sLRIG1蛋白10μg/ml，加100微升/孔到ELISA酶标板，封口膜封口，置4℃冰箱过夜；然后倒出sLRIG1蛋白，每孔300微升 1×TBS洗5次，每次5min，以洗去未结合的蛋白；每孔加5%脱脂牛奶200微升室温封闭1h后，双蒸水300微升/孔洗板5次，每次5min；最后每孔加200微升双蒸水，封口膜封口，4℃储备备用。
空调节能改造3.筛选和洗脱：将噬菌体文库以100微升/孔置于包被有sLRIG1蛋白的ELISA酶标板内，室温放置1h后TBS 洗5次，加入10%SDS洗脱液200微升/孔，室温放置30min；反复吹打后吸出洗脱液，此即为筛选的噬菌体；取10μl测定所筛选噬菌体的滴度，余收集于EP管中4℃保存备用。
4.噬菌体的扩增:取LB液体培养基50ml，加入200mg/ml的Amp及活化的BLT5615细菌各50μl；置于37℃、240r/min摇菌培养2.5h；加IPTG(1mol/L)50μl继续恒温摇菌培养30min。之后加入经sLRIG1蛋白筛选的噬菌体洗脱液感染BLT5615菌，继续摇菌2.5h至菌体裂解。将菌液转移至无菌离心管8000×g离心10min，将上清转移至另一无菌管，4℃储存。反复3～5轮筛选直到噬菌体效价稳定，最后挑取单个噬菌斑进行PCR测定。
5.PCR测定:用10μl灭菌微量加液器挑取单个噬菌斑(只挑取顶层培养基部分)，加到心管EDTA液体中，每挑取一个噬菌斑更换一个微量加液器；短暂震荡混悬后65℃水浴加热10min；室温冷却，12000×g 5min高速离心；取2μl作为模板用Taq聚合酶进行PCR反应。所用引物：T7上游引物：5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′，T7下游引物：5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′。反应条件为：94℃ 4min；94℃ 50s；50℃1min；72℃1min；35个循环；72℃延伸10min。琼脂糖电泳照相后按照原平皓生物公司琼脂糖凝胶DNA快速纯化试剂盒说明书纯化回收NDA，送Invitrogen公司测序，到NCBI的EST数据库对测得的核苷酸序列进行比对，将结果进行聚类分析、同源性搜索与功能预测等生物信息学分析，得到和sLRIG1蛋白有相互作用的蛋白或多肽的信息。
结 果
1.筛选T7人类肝细胞cDNA的结果:经过6轮的筛选，第3轮至第6轮噬菌体的洗脱量达到106PFU,噬菌体的投入量、产出量及投入/产出比见表1。T7噬菌体投入/产出比随筛选次数增加先是降低，然后趋于稳定，这就表明后来的噬菌体富集程度已趋于饱和，大多数噬菌体都可以和sLRIG1蛋白相结合。
表1 筛选时不同轮次噬菌体的投入量和产出量(PFU)筛选轮次噬菌体投入量噬菌体产出量投入/产出12.0×10121.6×106 1.25×10626.0×109 2.4×1062.50×10339.0×10116.6×106 1.36×10543.0×10131.0×1073.00×10656.0×10137.4×1068.11×10662.4×10131.3×1071.85×106
2.利用特异性PCR引物扩增插入片段，回收产物:共送96个样本到Invitrogen公司测序，将测序结果进行较读。将得到的35个序列分别在NCBI的EST数据库按照人类核苷酸序列进行BLAST比对，得到12个编码蛋白的序列，详见表2。
表2 BLAST后得到的12个蛋白编号蛋白名称1酮戊二酸脱氢酶样蛋白(oxoglutarate dehydrogenase-like, OGDHL)2真核细胞翻译起始因子2C1 (eukaryotic translation initiation factor 2C, 1, EIF2C1)3细胞周期蛋白M3(cyclin M3, CNNM3) 4白蛋白(albumin ,ALB)5载脂蛋白C3(apolipoprotein C-III ,APOC3) 6可溶性凝集素半乳糖苷8(lectin, galactoside-binding, solu-ble, 8,LGALS8)7特异性双磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6, DUSP6)8乙醇脱氢酶1B (alcohol dehydrogenase 1B, beta polypeptide,ADH1B)9胞质动力蛋白轻链(dynein, light chain, LC8-type 2, DYN-LL2)10玻连蛋白(vitronectin, VTN)11高迁移率组蛋白(high-mobility group nucleosomal binding domain 2, HMGN2)12节点调节蛋白2(NODAL modulator 2, NOMO2)
讨 论
当前，蛋白质组学越来越成为生物医学研究的热门。其中应用于研究蛋白质间相互作用的技术主要是酵母双杂交系统和噬菌体展示技术，与酵母双杂交系统相比，噬菌体展示技术更简单、方便、高通量。结合本研究目的及实验条件，选择了噬菌体展示技术。同时因为sLRIG1蛋白在肝细胞表达较高，所以选用肝细胞T7噬菌体展示文库作为原始文库。 通过sf9昆虫表达出重组的sLRIG1蛋白，经过高效亲和层析纯化，经SDS-PAGE鉴定纯度达到95%以上，经过Western blot法检测表达正确，具有生物学活性，为有效筛选出特异性结合的蛋白打下了坚实的基础。
用纯化的sLRIG1蛋白为靶蛋白，筛选人肝细胞T7噬菌体文库，一共进行了6轮筛选，第3～6轮噬菌体的洗脱量达到106PFU，投入产出的比例先减小，后趋稳定，表明后来的噬菌体富集程度已趋于饱和。富集的大多数噬菌体可以和sLRIG1蛋白相结合。3～5轮富集程度达到稳定，和文献报道的筛选轮次相一致[5]。为了进一步提高筛选的特异性，本研究增加了一轮筛选。蚀斑实验可以计数噬菌体滴度，是评估噬菌体富集的基础。在最后一次筛选出的噬菌体测滴度的同时在较高稀释度的蚀斑实验培养皿中可以分离噬菌体克隆，以便测
序分析。在挑取噬菌斑时挑取相对较大的噬菌斑，较大的噬菌斑提示噬菌体感染力强。还是有数个噬菌体扩增出2～3条条带，可能是几个噬菌斑融合在了一起，形成了混合噬菌体克隆。经过纯化回收PCR产物再送测序保证了DNA的纯度，保证了测序免受杂质的干扰，保证了测序的准确性和可靠性。这样从96个噬菌斑得到96份PCR产物，经T7下游引物测序，测序结果到NCBI的EST数据库比对，得出的35份报告有5个序列为染体读码框，其余有多个序列相互重复，最终得到12个编码蛋白质的序列(表2)。这只是初步的筛选，还有待于今后进一步论证。实证研究
噬菌体展示系统最大的优势就是将基因型和表型相结合，与靶蛋白亲和的噬菌体展示蛋白与其基因共同位于同一体系，经过蚀斑实验分离，在经PCR扩增基因DNA后测序鉴定基因型，再从基因型就可以推导出靶蛋白的相互作用目的蛋白，同时表明插入的部分序列对应的肽段就很可能是该蛋白与靶蛋白相结合的靶位点，为后续sLRIG1的作用机制研究提供了重要线索。既往研究表明sLRIG1与多RTK有关，但是本研究中没有筛选到RTK蛋白，而是筛选到其他12个新的蛋白，正如Xu等[3]的研究中并没有发现sLRIG1与EGFR有直接的结合，这表明sLRIG1的作用机制还需要进一步研究。
参考文献
【相关文献】
1 Ledda F, Bieraugel O, Fard SS, et al. Lrig1 is an endogenous inhibitor of Ret receptor tyrosine kinase activation, downstream signaling, and biological responses to GDNF[J]. J Neurosci,2008,28:39-49
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