1.1 DNA重组技术的基本工具
1.基因工程（有性生殖）是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 2.基因工程的原理是基因重组（变异是定向的），突破了生殖隔离，实现了不同生物之间的基因重组。
tl3.基因工程的基本工具：
（一）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）
1．来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
2．功能：识别特定的核苷酸序列，切割特定的位点使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．特点：专一性。
4．结果：黏性末端和平末端。
（二）“分子缝合针”——DNA连接酶
1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶(来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接)和T4DNA连接酶(来源于T4噬菌体，能缝合黏性末端和平末端，但连接平末端之间的效率较低)两类。
2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（三） “分子运输车”——载体（不是工具酶）
1.载体具备的条件：
A.能在受体细胞中保存并大量复制；
B.有一至多个限制酶切割位点；
C.具有标记基因（供重组DNA的鉴定和选择）；
D.对受体细胞无害。
2.基因工程常用的载体有：质粒 、入噬菌体的衍生物和动、植物病毒等。
最常用的载体是质粒（常存在于原核细胞和酵母菌中）,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
3. 功能：a.将基因送入细胞中；b.在受体细胞内对目的基因进行大量复制并稳定保存。 1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本过程什么是以火灭火：目的基因的获取、基因表达载体的构建（核心）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
(一) 获得目的基因（主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些有调控作用的因子 ） 1.获取方法主要有两种：①从自然界中已有的物种中分离出来；②人工合成。
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反转录法（真核生物）和化学合成法。
★真核生物的基因转移到原核生物中不能翻译出蛋白质原因：不能切除内含子转录的部分，无法加工形成成熟的mRNA。
2.利用PCR技术扩增目的基因
（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
（2）目的：获取大量的目的基因。
（3）原理：DNA双链复制。
（4）前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以此合成引物。
（5）过程： 第一步：加热至90～95℃，DNA解链为单链（不需要解旋酶）；
第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合（碱基互补配对原则）；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶（Taq酶,耐高温）从引物起始进行互补链的合成（原料：四种脱氧核苷酸）。
（5）特点：指数形式扩增，全解旋再复制，半保留复制。
(二) 制备重组DNA分子
1．重组DNA分子的组成：除了目的基因外，还必须有标记基因。
2.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
3.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端，作用是终止转录。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
★基因表达载体的构建过程中，最好用同种限制酶切割目的基因和载体，以获得相同的黏性末端，便于二者进行连接。但有时可用两种限制酶分别切割载体和目的基因，这样可避免载体与载体之间、目的基因与目的基因之间的自身连接，还可以确保目的基因和载体的正向连接。
3．方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。
(三) 转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）
1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法：
①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法（适用于双子叶植物和裸子植物，Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞并整合到受体细胞染体的DNA上），其次还有基因法（适用于单子叶植物）和花粉管通道法。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。
霍尔效应③将目的基因导入微生物细胞：Ca2＋处理法。
原核生物特点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
(四)目的基因的检测与鉴定
1.首先要检测转基因生物的染体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
成功标志：出现杂交带
2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用分子杂交技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原—抗体杂交技术。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。
★注意：①DNA分子杂交和核酸分子杂交(DNA和mRNA之间)的依据均是碱基互补配对原则。②探针就是用放射性同位素或荧光分子标记的含目的基因的单链DNA片段。
★基因探针，是一段带有检测标记，且序列已知的、与目的基因互补的核酸序列。
1.3 基因工程的应用
1．运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限；克服远源杂交不亲和的障碍。
2．基因工程的应用
（1）植物基因工程（受体：受精卵或体细胞）：抗虫（Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等）、抗病（植物：病毒外壳蛋白基因；病毒的复制酶基因 真菌：几丁质酶基因；抗毒素合成基因）、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
（2）动物基因工程（是为了改善畜产品品质，不是为了生产体型巨大的个体 受体：受精卵）：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质（eg.将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低），用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体（选择猪器官原因：其内脏构造、大小、血管分布与人极为相似；体内的隐藏致病病毒远少于灵长类动物威武之师背后的财经密码）
★乳腺生物反应器的优点：①产量高；②质量好；③成本低；④易提取。
缺点：处于生殖期的雌性动物才可产生药用蛋白（膀胱生物反应器：任何生长期的雌雄动物均可）
★为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？
①乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。
②从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。
③从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。
（3）基因诊断和基因：
基因诊断（DNA诊断）：是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。
原理：DNA分子杂交原理。
基因：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的方法（正常基因的表达掩盖缺陷基因的功能，而不是代替缺陷基因本身）。
原理：基因工程。
体外基因：操作复杂，但效果较为可靠
体内基因：操作简便，直接向人体组织细胞中转移基因
★基因工程药品：利用基因工程方法制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。（工程菌:用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。）
1.4 蛋白质工程的崛起
1.蛋白质工程的概念：以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因
修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
2.蛋白质工程的基本原理：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）
★蛋白质工程与基因工程区别
| 蛋白质工程 | 基因工程 |
实质 | 通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质 | 将目的基因从供体转移到受体细胞，并在受体细胞中表达 |
结果 | 合成自然界不存在的蛋白质 | 只能生产自然界已存在的蛋白质 |
联系 | 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程 | 2018年刘伯温全年资料
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新安琪儿
★用蛋白质工程制作的电子元件特点：体积小，耗电少，效率高。
★蛋白质工程难度很大原因：蛋白质的高级结构十分复杂，对其了解很不够。
★蛋白质工程操作对象：基因。
原因：比对蛋白质直接进行改造要容易，且改造过的基因可以遗传给后代。
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