基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个方面理解：
知识点二 基因工程的基本工具
三一混凝土输送泵
1.限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)限制性内切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。
(2)限制性内切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链
上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。
(3)限制性内切酶的切割方式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。
2.DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)来源：大肠杆菌、T4噬菌体
(2)DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
(3)作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。
注意：比较有关的DNA酶
设计材料(1)DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成磷酸、脱氧核糖和含氮碱基
(2)DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。(3)DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。
(4)DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。
3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。
(2)运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 (3)作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制 ②有多个限制性内切酶切点 ③有一定的标记基因，便于筛选。
教材拓展：
拓展点一 限制酶所识别序列的特点
限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如：以中心线为轴，两侧碱基互补对称;为轴，两侧碱基互补对称。
拓展点二 DNA连接酶连接的是什么部位?
DNA连接酶是将一段DNA片段3′端的羟基与另一DNA片段5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键，而不是连接互补碱基之间的氢键。
【基因工程的基本操作程序】
教材梳理：
基因工程的基本操作步骤为四步曲：目的基因的获取;基因表达载体的构建;将目的基因导入受体细胞;目的基因的检测与鉴定。
一.目的基因的获取
1.目的基因：主要是指编码蛋白质的结构基因。
2.目的基因的获取方法：
注:需要重点复习的内容有：a基因组文库与部分基因文库的含义及区别；建立基因文库的目的；如何从基因文库中获取目的基因； b逆转录法的过程 ，c PCR技术(原理、场所、条件、过程、特点)DNA复制与PCR技术列表比较。如下所示：
(1)从基因文库中获取
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的体储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
构建基因文库的目的：为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
基因组文库：含有一种生物的所有基因。
部分基因文库(如cDNA文库)：含部分基因，可由mRNA反转录而来。
(2)利用PCR技术扩增目的基因
PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
原理：DNA双链复制
原料：模板DNA;RNA引物;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶(Taq无线收发酶);
方法：DNA受热变性解旋为单链、冷却后RNA引物与单链相应互补序列结合、DNA聚合酶作用下延伸合成互补链。
过程：热变性(90-95℃ )、退火(55-60℃)、延伸(70-75℃)。
特点：指数形式扩增
二.基因表达载体的构建(基因工程的核心—体外进行)
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在;可以遗传给下一代;使目的基因能够表达和发挥作用。
3.方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用中国红丝带网DNA连接酶把两者连接。
目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)
4.条件：同种限制酶、DNA连接酶、(目的基因、启动子、终止子、标记基因)
三.将目的基因导入受体细胞
转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
①导入植物细胞：常用农杆菌转化法中国生物工程杂志(将构建的载体导入农杆菌，再让农杆菌感染植物细胞)，基因法、花粉管通道法。
②导入动物细胞：显微注射法(将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中)
③导入微生物细胞：Ca2+处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。
提示：农杆菌转化法的原理是利用农杆菌(胞内寄生菌)对植物的感染而把目的基因导入受体细胞。
四.目的基因的检测和鉴定
分子检测：导入检测+表达检测
①导入检测：利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。
②表达检测：目的为了检测是否转录出了mRNA，利用DNA-mRNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。
③表达检测：目的为了检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原-抗体杂交，看是否有杂交带。
个体水平的鉴定：进行抗虫、抗病的接种实验，根据其性状判断是否表达。
提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交;②抗原-抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的
【 基因工程的应用】
教材梳理：
知识点一 植物基因工程的应用
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗
盐碱等)以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
1.提高抗逆性
(1)常用抗虫基因：用于抗虫(杀虫)的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)常用抗病基因：a.抗病毒基因有：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因;b.抗真菌基因有：几丁质酶基因和抗毒素合成基因
(3)其他抗逆基因：环境条件对农作物的生产会造成很大影响，并且这些影响是多方面的，因此，抗逆性基因也有多种多样，如：抗盐碱和干旱的调节细胞渗透压基因、抗冻基因、抗除草剂基因等等。
2.改良植物品质
由于人们的食品含有的营养不平衡，不能满足人们对食品的要求，这样，可以通过转基因技术，使植物能够合成某些本来不能合成的物质。如科学家将必需氨基酸含量多的蛋白质
编码基因导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种关键酶的活性，以提高氨基酸的含量。
知识点二 动物基因工程的应用
1.用于提高动物生长速度：由于外援生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。如：转基因绵羊和转基因鲤鱼。
2.用于改善畜产品的品质：基因工程可用于改善畜产品的品质。如：有些人对牛奶中的乳糖不能完全消化或食用后会出现过敏、腹泻、恶心等不适症状，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，这样所获得的牛奶其成分不受影响，但乳糖的含量大大减低。
3. 生产药物
基因工程不但促进了传统技术的变革，也为人类提供了传统产业难以得到的许多昂贵药品，并已形成基因工程制药业的雏形。目前诸如人胰岛素、人生长激素、人脑激素、α-干扰素、乙肝疫苗、蛋白C、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂等数十种基因工程药物已实现商品化。此外，还有促红细胞生成素、白细胞介素-2、肾素、心钠素等一大批珍贵药品正处
于试用或临床试验阶段。
棉纺工艺设计
（3）在没有迁入迁出、突变和选择等条件下，一个由纯合果蝇组成的大种个体间自由交配得到F1 ，F1中灰体果蝇8400只，黑檀体果蝇1600只。F1中e的基因频率为_______________，Ee的基因型频率为________。亲代体中灰体果蝇的百分比为________。
（4）灰体纯合果蝇与黑檀体果蝇杂交，在后代体中出现了一只黑檀体果蝇。出现该黑檀体果蝇的原因可能是亲本果蝇在产生配子过程中发生了基因突变或染体片段缺失。现有基因型为EE，Ee和ee的果蝇可供选择，请完成下列实验步骤及结果预测，以探究其原因。（注：一对同源染体都缺失相同片段时胚胎致死；各型配子活力相同）实验步骤：
①用该黑檀体果蝇与基因型为_______________的果蝇杂交，获得F1 ； ②F1自由交配，观察、统计F2表现型及比例。
结果预测：I．如果F2表现型及比例为__________________，则为基因突变； II．如果F2表现型及比例为_________________，则为染体片段缺失。
【答案】（1）EeBb ；eeBb（注：两空可颠倒）；eeBb （2）1/2
（3）40%；48%；60% （4）答案一：①EE I．灰体∶黑檀体=3∶1 II．灰体∶黑檀体=4∶1 答案二：①Ee I．灰体∶黑檀体=7∶9 II．灰体∶黑檀体=7∶8
【解析】根据实验一中灰体∶黑檀体=1∶1，短刚毛∶长刚毛=1∶1，得知甲乙的基因型可能为EeBb×eebb或者eeBb×Eebb。同理由实验二的杂交结果，推断乙和丙的基因型应为eeBb×EeBb，所以乙果蝇的基因型可能为EeBb或eeBb。若实验一的杂交结果能验证两对基因E，e和B，b的遗传遵循自由组合定律，则甲乙的基因型可能为EeBb×eebb，乙的基因型为EeBb，则丙果蝇的基因型应为eeBb。
（2）实验二亲本基因型为eeBb×EeBb，F1中与亲本果蝇基因型相同的个体所占的比例为1/2×1/2+1/2×1/2=1/2，所以基因型不同的个体所占的比例为1/2。
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