飞秒激光脉冲技术在生物学中测量领域也有广泛的应用。例如利用时间分辨的透射光谱测量组织的散射和吸收，并检测脑内血红蛋白的氧化。飞秒光学测距技术已应用于视网膜和皮肤的微观结构测量[1]。更引人注目的是对于透明物体的双光子吸收荧光显微镜[2]和对于高度散射物体的光学断层扫描（层析）成像技术的发展[3]。飞秒激光成像技术的最大优点是高分辨率。本章着重介绍这两种成像技术。 14.1飞秒激光显微镜
14.1.1双光子吸收荧光显微镜
共焦显微镜是普通光学断层扫描成像仪器之一，其原理如图14.1.1所示，激光光源聚焦在被测物体上。在显微镜探测器前放一小孔光阑，只允许物镜焦点的光进入探测器，而离焦的光线则被挡住。这样就可以只观察和记录在焦点的发光。如果做横向和纵向的扫描，就可得到被观察物体的三维成像。该成像技术已经被广泛应用于观察活体生物。但是利用共焦显微镜观察存在如下问题：1）观察生物样品常常要涂荧光染料。这些染料通常需要用紫外光来激发。但是强紫外光对活体生物样品有杀伤作用。2）焦点的小孔光阑尺寸对显微镜分辨率有显著影响。光阑太大，分辨率就会降低；光阑太小，则通过的光太弱，影响信噪比。
双光子吸收[4] (Two Photon Absorption: TPA）荧光显微镜是用红外光源代替紫外光源, 利用非线性效应, 使染料吸收两个红外光子获得激发而发光的技术。Kaiser等在CaF２: Eu2+晶体中首次观察到了双光子激发现象[5]。1990年Denk 和Webb 首次将双光子激发应用到共聚焦荧光显微镜中[2]。在双光子吸收显微镜中，该非线性吸收效应将染料的激发局限在焦点，即只有在焦点处光强达到一定程度时, 双光子吸收作用才明显增强，在焦点之外由于光强相对较弱, 不能产生双光子吸收而发光。因此只在空间的某一点即焦点发光（如图14.1.2）。相对于紫外光光源，双光子吸收荧光显微镜仅需要可见光或者红外光作为激发光源，也不需要用紫外透过率高的物镜，可以减少紫外光对于样品的光漂白和光损伤。这是双光子吸收激发荧光的主要优点之一。把激发光局限在焦点，而不是整个样品，小孔光阑也就不是必要的了，这样就不会限制入射到探测器的光子数目，有利于提高信噪比。另外，荧光发光强度正比于激发光强度的平方，有效地减少了发光点的尺寸，提高了分辨率（如图14.1.3）。多光子吸收法采用更长波长的光源，分辨率会更高。
三噻吩图14.1.1 共焦显微镜及相关显微镜结构示意图
(a) (b)
图14.1.2 单光子吸收荧光和双光子吸收荧光在空间上发光区域的区别。(a) 染料盒上部是单光子吸收，发光是线状；下面的光点是双光子吸收激发的。(b) 二能级系统单光子和双光子激发示意图。
图14.1.3 花粉颗粒的影像。显示出单光子和双光子吸收图像的区别。单光子激发光波长是488nm，而双光子激发光波长是704nm[6]。双光子吸收成像对边缘的观察更清晰。
14.1.2三次谐波（THG）显微镜
由于荧光标记染料会对活体细胞造成或多或少的损伤，双光子吸收荧光显微镜的应用就存在其固有缺陷，而三次谐波发生显微镜对活体样本几乎不造成任何损伤。对于高数值孔径的光学系统，产生于生物样品的三次谐波(Third Harmonic Generation: THG)与光强的三次方成正比，从而获得1 m3的空间
分辨率。当超短脉冲激光聚焦在样品的均匀部分上，很少或者没有THG出现；而当激光照射在样品的边缘区域，即折射率存在变化或者是非线性系数较大的部分，会观察到很强THG信号。该信号很容易区别于基频光，意味着可以提供无背景光的图像。该术的独特优势在于，用THG法测量本来非常对比度很低的生物边界，可变得非常清晰，而不必引入有毒的荧光染料标记。此外，在观察一个细胞几个小时的三维变化时，如果用荧光染料标记，由于染料的漂白效果，记录的图像就会逐渐褪。而用THG技术，因为发光体是自体荧光，不会被漂白，所以观察到的图象可以保持非常好的重复性。具有讽刺意味的是，超慢过程的观察可以用超快光源来解决！
当然，三次谐波产生是依赖高光强的非线性效应，细胞要承受100GW/cm2甚至更高的光学通量。这样高的通量可能会对被观察的细胞造成损害。值得注意的是，多数THG显微术可以用和TPA显微术同样的光强来完成。而且，这两个过程往往同时发生，提供互补的图像。图14.1.4是THG和TPA 技术合成的神经细胞图像。
利用非线性光学的显微成像技术还有光学克尔效应（OKE）显微镜，三光子回波显微镜以及与相干受激拉曼散射结合的显微镜等，详见参考文献[7]。
图14.1.4THG和TPA 技术合成的神经细胞图像[7]。细胞核发出的是TPA绿光，紫光是THG发出的，显示出细胞的边缘。激发光波长是810 nm。
14.2光学相干层析技术（OCT）
双光子（或者多光子）荧光显微镜为透明物体的观察提供了比较有效的手段，而散射物体或者透明度比较低的混浊物体(例如生物组织)的成像技术，对科研人员是一个挑战。光学相干层析法（相干快门法选择散射最小的光子）是解决方案之一。
层析成像技术，例如X-射线计算机断层扫描(CT)，核磁共振成像，及超声波成像技术已经广泛应用于医疗诊断。每种技术都有其独特的分辨率及穿透深度, 可以测量不同的物理特性。近年来，光学相干层析(Optical Coherence Tomography, 简称OCT)正在快速发展起来。这种技术的原理实际上与超声波诊断技术相同，却比超声波有更高的分辨率。OCT是利用生物样品对红外激光的反射对其内部结构进行非破坏性的活体(in vivo)断层成像。它实际上是一个迈克尔逊干涉仪，测量反射光与参考光的干涉信号。如图14.2.1所示，入射到散射物体中的光可能经过多次散射而行走不同的距离。由于低相干光的相干长度很短，散射光只与相等光程的参考臂的光发生干涉，参考臂形成了“定位”的作用。又因为经过散射次数最少的光具有最强的光强，这样就把光程锁定在最短（图14.2.1）。超短光脉冲和低相干光都可用来测量生物的内部结构。对生物体透明的光，其反射或透过光含有飞行时间信息，从而就包含着生物组织的空间微观结构的信息。这里，光学断层扫描成像质量所强调的是分辨率和信噪比，超短脉冲的时间特性并不重要。
(a) (b)
图14.2.1光学相干层析法：(a) 混浊物体中光的散射与路径长度；(b) 利用相干性作为“快门”，选择经历最小散射路径的光子。
14.2.1 部分相干光的空间干涉
从普通光学我们知道，相干光源的特性是具有相同的单光，具有相同的波长和恒定的位相关系；非相干光源则具有宽谱带和随机的位相关系。而部分相干光源具有宽带光谱（带宽10~100nm ）。考虑麦克尔逊干涉仪中单光的干涉，如果参考臂和探测臂存在空间光程差L ∆，那么接收器检测到的光强I 满足
12()()/)I I I L c ωωω=++∆
(14.2.1) 其中I 1、I 2分别对应探测臂和参考臂光强，ω为单光源的频率，c 为真空中光速，s r L L L -=∆2，r L 和s L 分别是参考臂和探测臂的长度。
如果光源含有很多频率分量，对于分立的频率成份，交叉项是对各个频率分量的求和
)/cos()(2),(1021c L I L m
i i m ∆=∆Γ∑=ωωωωω
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(14.2.2)
对于连续谱，交叉项是光谱密度的积分，其表示为
ωωωd c L I L )/cos()(2)(0∆=∆Γ⎰∞ (14.2.3)
对于OCT 的仪器，考虑到两臂光的信号强度的不同，以r K ，s K 作为振幅比例系数，参考臂和探测臂的光振幅分别是
)()(0/ωωωA K e A r c L i r r = )()(0/ωωωA K e A s c L i s s =
(14.2.4) 这样，探测器接收到的信号是 )(L I I I OCT s r OCT ∆Γ++=
(14.2.5) 其中最重要的交叉项信号是
ωωωd c L I K K L s r OCT )/cos()(2)(0∆=∆Γ⎰∞ (14.2.6)
图 14.2.2 窄带光源（超荧光二极管SLD ）与飞秒激光脉冲的相干长度的比较。左边是光源的光谱，右
边是光谱的空间傅立叶变换。相干长度也表示其中。
假设光源的功率谱是高斯型，其FWHM 带宽是ω∆，
20]/)[(2ln 421)()(ωωωλλ∆--∝≈e I I (14.2.7)
那么交叉项积分的结果就是
)/cos()(2)/(2ln 4c L e L c L L OCT ∆∝∆Γ∆-ω (14.2.8)
其中，c L 是所谓“相干长度”，亦即OCT 的纵向分辨率，定义为[8]
λλλλπ∆≈∆=/44.0)/](/)2ln(2[22c L (14.2.9)
相干长度与分辨率的概念可以从图14.2.2看出。窄带光源和宽带光源在空间上相干的长度是不一样的。显然，宽带光源的相干长度变短，有利于提高OCT 的纵向分辨率。在生物组织中，自由空间的分辨率还应除以组织的折射率，多数生物组织的折射率为1.35~1.45。标准的OCT 用超荧光半导体二极象征图形
管作为光源，具有纵向分辨率10~15μm ，采用800nm 中心波长的钛宝石激光器的激光脉冲可以获得1μm 的分辨率；在1.3μm 波长区域，用宽带啁啾镜的镁橄榄石激光器做光源，分辨率可达5.1μm 。
14.2.2 光学相干层析仪
最初的OCT 用超荧光半导体二极管做光源，其优点是简单和低振幅噪音。但是它的有限的带宽使得其分辨率只有20μm ，这使其难以作为细胞水平成像的光源。而且，高速扫描成像需要几毫瓦以上的光功率，这超出了一般超荧光半导体二极管所能达到的水平。超短脉冲光源一般具有很宽的谱宽，因此它的相干性很低, 分辨率可达2μm 。而其输出功率远大于几毫瓦的水平。飞秒激光脉冲极高的峰值功率也有利于提高信噪比。在波长的选择方面, 人体组织对近红外的钛宝石激光(波长0.8μm)吸收相对较弱，而散射较强；对波长2μm 以上的光，散射最小，但是水的吸收太大。实验证明，波长1.3μm 的红外光对于人体组织有较好的对比度和穿透深度。比较适用的激光材料是掺铬镁橄榄石(Cr:forsterite, 详见第六章)。 麻省理工学院藤本(J. Fujimoto) [9]领导的小组制作的OCT 装置如图14.2.3。光源是镁橄榄石锁模激光器。输出脉宽是25fs, 带宽是50nm, 对应的相干长度是15μm 。由于激光器的输出模式是理想的单横模, 可以很容易地耦合入单模光纤。光纤通过一个50:50分配器把光分成两束, 一束作为探测光, 另一束是参考光。分别被样品和反射镜反射, 形成一个迈克尔逊干涉仪。参考臂的反射镜在计算机控制下以30mm/s 的速度做锯齿形扫描，从而产生50kHz 的多卜勒频移。收到的信号经过滤波、解调、数字化，然后储存于计算机中。所有的信号按照平面扫描顺序一行一行地排起来, 最后显示出伪
彩图像或黑白灰度图像。15μm 的相干长度仍然太长。为了缩短相干长度，需要进一步增加光谱宽度。
激光器发出的光谱宽度受限于激光介质，而且在这个极限带宽内的宽带光谱的产生强烈依赖于腔内散补偿技术[10]。能不能在腔外增加带宽呢? 能，那就是第十章介绍的利用非线性效应展宽光谱的技术。例如让100mW 左右平均功率的脉冲通过SMF/DS CPC3散位移光纤(零散不在1.3μm, 而在1.5μm)。利用这种光纤的自相位调制和散, 光谱被展宽了约3倍多，因而相干长度缩短到5.1μm [11]。光子晶体光纤的出现，为在腔外产生超宽带光谱提供了更加简单而有效的方法，进而可以实现更高的分辨率。Hartl 等人12利用光子晶体光纤把钛宝石激光脉冲的波长展宽到1.3μm 以上，并把在中心波长1.3μm 、谱宽370 nm 的光谱用滤波器滤出，纵向分辨率在空气和生物组织中分别达到2.5μm 和2μm ，这是在该波段已经达到的最高分辨率。
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图 14.2.3 光纤集成的光学相干层析系统。光源是镁橄榄石激光器。A-D 是数/模转换器，D1, D2是光探测器。
图14.2.4 人类脂肪组织的活体OCT图像。光源是镁橄榄石激光器。组织微结构包括膜质和细胞间的空间都可以分辨出来。
图14.2.4是一幅人体脂肪组织的OCT图像。这个图像包含有600⨯200个取样点，横向扫描间隔是3μm。光源是镁橄榄石锁模激光器，样品接收到的平均照射功率是2mW，测得的信噪比是115dB。获得这样一祯图需要30秒钟。
要做生物活体检验, 这样的速度仍嫌太慢。速度慢的原因是参考臂反射镜的机械扫描器(galvo)的速度慢。为了提高扫描速度, 藤本等人把光纤缠绕在压电换能器鼓上, 利用压电效应高速伸缩光纤, 以达到高速改变光程的目的[13]。增加缠绕的圈数可增加光程至3mm。光程改变速度(扫描速度)是3m/s, 重复频率是600Hz。这样, 获得一幅300⨯250点阵的图像只需要250ms, 即一秒钟可获得4幅图像。
利用类似的OCT系统，并与其他成像器件结合，可做成内窥镜，进行活体检测，例如动脉造影，骨科软骨组织造影、早期皮肤癌诊断，妇女生殖系统疾病和肠胃管道系统疾病的早期诊断等，详见参考文献[14]。
参考文献：
1Fujimoto J G, De Silvetri S, Ippen E P, et al, Femtosecond opticsl ranging in biological systems,Opt. Lett, 1986, 12 (2): 158~160
2Denk W, Strickler J M and Webb W W, Two-photon laser scanning fluorescence microscopy, Science, 1990, 248: 73~76
交博汇3Huang D, Swanson E A, Lin C P, et al, Optical coherence tomography, Science, 1991, 254:1178~1181
4Göppert-Mayer M, Uber elementarakte mit zwei quantenpsprungen, Ann. Phys, 1931, 9: 273~279
5Kaiser W and Garrett C G B, Two-Photon Excitation in CaF
2: Eu2+, Phys. Rev. Lett, 1961, 7: 229~232
6www.cbit.uchc.edu/faculty_nv/campagnola/shg.html
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8Swanson E, Huang D, Hee M R, et al. High-speed optical coherence domain reflectometry, Opt. Lett, 1992, 17(2): 151~153奥修的书
9Bouma B E, Tearney G J, Bilinsky I P, et al, Self-phase-modulated Kerr-lens mode-locked Cr:forsterite laser source for optical coherence tomography, Opt. Lett, 1996, 21(22):1839~1841
10Morgner U, Kaertner F X, Cho S H, et al, Sub-two-cycle pulses from a kerr-lens mode-locked ti:sapphire laser, Opt. Lett, 1999, 24 (6): 411~413
11Boppart S A, Bouma B E, Pitris C, In vivo cellular optical coherence tomography imaging, Nature Med. 1998, 4: 861~864
12Hartl I, Li X D, Chudoba C, et al, Ultrahigh-resolution optical coherence tomography using continuum generation in an air silica microstructure optical fiber, Opt. Lett, 2001, 26(9):608~610
13Tearney G J, Bouma B E, Boppart S A, et al, Rapid acquisition of in vivo biological images by use of optical coherence tomography, Opt. Lett, 1996, 21(17): 1408~1410
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