免疫组化（IHC）经验超全总结
做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。 1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一
步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？
1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染（可以通过封闭等避免）。 2.应用范围的选择。有的一抗只能用于WB（Westernblotting）或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。踏雪寻梅合唱
3.种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。
4.种属来源，一般兔来源的多是多克隆；而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。
5.生产厂家的选择。不同厂家的同一种抗体，它的实际效价稳定是不同的，有的做免疫组化效果较好，有的WB效果却更好一些。
三、在什么情况下使用Triton-X100？
1.TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10μm以上厚切片)和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。
2.其作用原理：TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大
分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
3.TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。
四、封闭血清的选择原则是什么？
1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。
2.封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
五、抗体孵育条件的比较？
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1.一抗孵育温度有几种：4oC、室温、37oC，其中4oC效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37oC，1-2h，而4oC过夜和从冰箱拿出后37oC复温45min。
硫酸铵盐析2.二抗一般室温或37oC，30min-1h，具体时间需要摸索。
六、一抗4℃孵育后为什么要进行37℃复温？
1.一方面，防止切片从4oC直接放入PBS易脱片。
2.另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4oC和37oC时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染。
3.其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4℃过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。
全民健身计划纲要七、DAB显时间如何把握？
南京航海技术学校1.DAB显时间不是固定的，主要由显微镜下控制显时间，到出现浅棕本底时即可冲洗。
2.DAB显时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。
3.若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。
4.DAB显时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4oC过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
八、免疫组化结果如何分析？
1.阳性着细胞计数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imageJ进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染程度（0-3分为阴性着、淡黄、浅褐、深褐）、阳性范围进行评分（1-4分为0-25%、26-50%、51-75%、76-100%），最终可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着均匀、背景很浅的高质量切片。
九、在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？ca126
1.由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。
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