作者简介：朱凌，女，硕士研究生研究方向：药代动力学 *
通讯作者：张双庆，男，博士，助理研究员
研究方向：药代动力学与药剂学Tel :(010)67872233-8220E-mail :zhangshq@hotmail ；李佐刚，男，研究员
研究方向：药代动力学
Tel :(010)67872233-8312
E-mail :lizg428@nicpbp．org．cn
LC-MS /MS 研究新型酪氨酸酶抑制剂UP302在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学 朱凌，张双庆*，闻镍，于敏，李佐刚
*
(中国食品药品检定研究院，国家药物安全评价监测中心，北京100176)
摘要：目的建立并验证测定大鼠肝微粒体孵育液中UP302含量的高效液相谱-串联质谱法，研究UP302在大鼠肝微粒体
中代谢的酶动力学。方法
经大鼠肝微粒体孵育的UP302样品，经谱柱分离，电喷雾离子化负离子检测，扫描方式为选择
反应监测，用于定量分析的离子反应分别为m /z 301.1→135.2(UP302)和m /z 252.9→132.0(内标大豆苷元)。考察不同孵育时间、底物浓度和微粒体浓度对UP302代谢的影响，确定最佳反应条件。结果 标准曲线线性范围为0.1 20μmol ·L －1
，线
性关系良好，日内日间准确度在86.42% 112.59%，日内日间精密度均小于9.09%，回收率在100.50% 109.91%之间。确
定了酶动力学参数，最大反应速度V max 为196.08μmol ·L －1·min －1·g －1，米氏常数K m 为14.98μmol ·L －1
，内在代谢清除率
CL int 为13.09mL －1·min －1·g －1。结论该检测方法快速、专属、灵敏度高，可满足酶动力学检测要求。
关键词:UP302；肝微粒体；酶动力学；液相谱-质谱联用法
中图分类号:R917
文献标志码:A
文章编号:1001－2494(2011)21－1665－05马克思主义认识论
Study on Metabolism Enzyme Kinetics of a Natural Novel Tyrosinase Inhibitor UP302in Rat Liver Micro-some by LC-MS /MS
ZHU Ling ，ZHANG Shuang-qing *，WEN Nie ，YU Min ，LI Zuo-gang *(National Center for Safety Evaluation of Drugs ，
National Institutes for Food and Drug Control ，Beijing 100176，China )ABSTRACT :OBJECTIVE
To establish and validate a LC-MS /MS method for the determination of UP302in rat liver microsome ，
and study the enzyme kinetics of UP302metabolism in rat liver microsome.METHODS
The LC-MS /MS method with mass transi-
tions of m /z 301.1→135.2for UP302and 252.9→132.0for internal standard daidzein was employed to determine UP302incubated in rat liver microsome at negative electrospray ionization mode.Different incubation conditions ，such as incubation time ，substrate con-centration and microsome concentration ，were optimized.RESULTS The linear range of the calibration curve was 0.1－20μmol ·
智血
L
－1
with good linear relationship.The intra-and inter-day accuracy was 86.42%－112.59%，and RSDs were less than 9.09%.The
enzyme kinetic parameters were as follows :maximum reaction speed V max of 196.08μmol ·L －1·min －1·g －1，K m of 14.98μmol ·L －1，and CL int of 13.09mL －1·min －1·g －1.CONCLUSION
The established LC-MS /MS method was fast ，simple ，specific ，sen-
sitive and successfully applied to investigate the enzyme kinetics of UP302metabolism in rat liver microsome.KEY WORDS :UP302;liver microsome ;enzyme kinetics ;LC-MS /MS
酪氨酸酶是一种含铜的金属氧化还原酶，在动植物、微生物及人体中广泛分布。酪氨酸酶催化酪氨酸羟化转变成多巴，同时氧化多巴形成多巴醌，多
巴醌再经过一系列反应，最后形成黑素［1］
。有关研究表明，酪氨酸酶活性与黑素的生成量呈正相关［2］
植绒胶。酪氨酸酶在黑素的生物合成过程中起着关键性的作用，是皮肤黑素合成反应的限速酶，参与决定了哺乳动物皮肤、头发等器官组织的颜。过量水平的黑素在表皮沉积可能导致如黄褐斑、雀斑等素障碍性皮肤病。酪氨酸酶抑制剂通过抑
制酪氨酸酶的活性，阻止酪氨酸向黑素转化。研发能抑制酪氨酸酶活性的物质将成为素障碍
性皮肤病的重要手段。此外，酪氨酸酶还参与果蔬的褐变反应，所以酪氨酸酶抑制剂也可作为食品保鲜剂。同时，它还能作为生物杀虫剂应用于农业的
抗虫领域［3］
。近年来，国内外学者致力于寻特异、高效的酪氨酸酶抑制剂，酪氨酸酶抑制剂的研究已成为热点领域之一［4］。
UP302是从药用植物山菅兰中分离得到的一种
新型酪氨酸酶抑制剂，化学名称为1-(2，4-二羟苯
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5661·中国药学杂志2011年11月第46卷第21期
Chin Pharm J ，2011November ，Vol .46No .21
基)-3-(2，4-二甲氧基-3-甲苯)丙烷。研究表明，UP302表现出很高的酪氨酸酶抑制活性，IC
50
值为0.24μmol·L－1；它可以显著改善皮肤的外表，能够减少皮肤素沉积，改善皮肤光泽，而没有普通化学成分的不良反应；它的美白效果比常用的对苯二酚和曲酸等美白剂的美白效果高20倍，且没
有不良反应［5-6］。UP302可用于乳霜、洗液、胶类、面膜和其他化妆产品中，其浓缩物用量仅为普通化学物质的1/10 1/50，可能是个前景看好的美白成分。UP302作为一种新型酪氨酸酶抑制剂，不仅是化妆品原料药的主要成分之一，由于对由于黑素增加引起的素障碍性皮肤病其具有潜在的作用，目前也正将其开发为素障碍性皮肤病的新型药物。
由于UP302是一种新型酪氨酸酶抑制剂，笔者尚未见有体外大鼠微粒体中代谢酶动力学的研究报道。本实验建立了一种灵敏且特异性的LC-MS/MS 方法来测定UP302，为其临床前及临床研究奠定了基础。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
TSQ Quantum Access型LC-MS/MS(美国Ther-mo Fisher公司)，三重四级杆电喷雾离子化电离源。Eppendorf5415R低温高速离心机，NTS－1300水浴摇床，DW－86L626超低温冰箱。
UP302原料(纯度99%，美国Unigen公司)；大豆苷元对照品(批号111502-200402，中国食品药品检定研究院)。甲醇(谱纯)，二甲基亚砜(DMSO) (分析纯);1mol·L－1甲酸铵溶液(谱级)。20mg ·mL－1大鼠肝微粒体，0.5mol·L－1磷酸盐缓冲液，NADPH再生系统包括NADPH-A和NADPH-B(美国BD Ge
ntest公司，临用前按5ʒ1混合)。NADPH-A含有31mmol·L－1NADPH+和66mmol·L－16-磷酸葡萄糖(G-6-P)，NADPH-B含40U·mL－1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)(溶于5mmol·L－1MgCl2中)。
1.2溶液配制
1.2.1UP302储备液的配制称取UP302适量，加入适量DMSO，超声直至完全溶解，得到质量浓度为10mmol·L－1的贮备溶液，－20ħ储存。
1.2.2内标大豆苷元储备液的配制称取大豆苷元对照品适量，加入适量甲醇，超声直至完全溶解，得到质量浓度为1mg·mL－1的标准贮备溶液，－20ħ储存。
1.2.3UP302和大豆苷元工作液的配制取10mmol·L－1UP302储备液，经50mmol·L－1磷酸盐缓冲液系列稀释，得到质量浓度为0.2，1，2，4，10，20，30，40，60，100，1000μmol·L－1的工作液。
大豆苷元储备液经甲醇稀释得到1μg·mL－1大豆苷元甲醇工作液，于－20ħ冰箱中储存，备用。
1.3谱条件
Hypersil Gold C
18
谱柱(2.1mmˑ50mm，1.9μm，Thermo Fisher Inc.，Waltham，MA，USA)，配有预柱Phenomenex C18(3.0mmˑ4mm)；流速为0.2mL·min－1；柱温为30ħ；进样量为10μL；整个分析时间为6min；流动相采用梯度洗脱，［0 0.5min，A和B比例为10ʒ90，0.5 2.0min A和B 比例从10ʒ90上升至90ʒ10;2.0 5.0min维持A 和B比例90ʒ10不变;5.0 5.1min A和B比例从90ʒ10下降至10ʒ90;5.1 6.0min维持A和B比例10ʒ90不变］，流动相:A相为甲醇，B相为5 mmol·L－1甲酸铵水溶液。
1.4质谱条件
电喷雾离子化电离源，喷雾电压3000V；加热毛细管温度300ħ；鞘气氮气，流速30Arb；辅助气氮气，流速10Arb；碰撞气氩气，流速1.5mTorr。UP302和大豆苷元的二级碰撞能量分别为31和39 eV；负离子方式检测；扫描方式为选择反应监测(SRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 301.1→135.2(UP302)和m/z252.9→132.0(内标大豆苷元)；扫描时间为0.2s。
竹镂舟蛾
1.5温孵条件
取150μL UP302工作液至1.5mL离心管中，加入新鲜配制的60μL1mg·mL－1大鼠肝微粒体，37ħ孵育5min，然后加入在37ħ预孵育5min的新鲜配制NADPH再生系统90μL，于37ħ水浴中震荡温孵，启动反应，开始计时。孵育总体积为300μL，其中肝微粒体蛋白浓度为0.2mg·mL－1，NADPH浓度为1.1mmol·L－1，DMSO浓度不超过0.1%。
1.6样品处理
取肝微粒体温孵液20μL，加入冰冷的内标大豆苷元甲醇溶液(含内标1μg·mL－1)60μL，终止反应同时沉淀蛋白，涡旋30s，于4ħ，12000r·min－1离心10min，取上清10μL进样分析。
2结果一汽佳宝6371
2.1方法学验证
2.1.1专属性分别将灭活的空白肝微粒体稀释液，孵育2min后的UP302样品，按照“1.6”项下的
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Chin Pharm J，2011November，Vol.46No.21中国药学杂志2011年11月第46卷第21期
方法处理后，进行LC-MS /MS 分析，结果见图1。比
较可见，
内标大豆苷元与UP302的保留时间分别为3.49和4.10min ，能够达到完全分离，相互不干扰，
内源性杂质对样品也无干扰。2.1.2
线性灭活空白肝微粒体中加入不同浓度
的UP302溶液及内标溶液，得到终浓度为0.1，
0.5，1，2，5，10和20μmol ·L －1
的肝微粒体系列溶液。分别按“1.6”项下的方法处理后，进行LC-MS /MS 分析，连续5d 操作。将UP302与内标大豆苷元的
峰面积比(Y )对加入的UP302的终浓度(X )按照最小二乘法进行线性回归，标准曲线线性范围为0.1 20μmol ·L －1
，结果见表1。相关系数r =0.9964，表明线性关系良好。2.1.3
精密度、准确度与提取回收率分别于灭活的肝微粒体稀释液中加入高、中、低浓度的UP302溶
液，按“1.6”项下的方法测定，以空白甲醇溶液为对照，用标准曲线计算UP302在微粒体体系中的日内
、日间精密度和准确度及提取回收率，结果见表2。日内日间准确度在86.42% 112.59%，日内日间精密度均小于9.09%，回收率在100.50% 109.91%。内标大豆苷元的提取回收率为(89.82ʃ1.97)%
。
图1空白大鼠肝微粒体(A )、加入10μmol ·L －1
UP302微
粒体孵育2min 后样品(B )的SRM 谱质谱图
Fig.1
SRM Chromatograms of blank rat liver microsome (A )，
microsome spiked with 10μmol ·L －1UP302after incubation for 2min (B )
表1UP302在大鼠肝微粒体中标准曲线
Tab.1
Calibration curves of UP302in rat liver microsome
Calibration curve r Y =0.01365X －0.0025880.9964Y =0.01155X －0.0027570.9983Y =0.01255X －0.0039320.9994Y =0.01427X －0.0017570.9997Y =0.01091X －0.004053
0.9994
表2UP302日内、日间精密度和准确度及提取回收率．n =5Tab.2
Intra-and inter-day precision ，accuracy and extraction
法家人性论
recovery of UP302．n =5
Concentration /μmol ·L －1
Intra-day /%Inter-day /%Recovery /%Accuracy RSD Accuracy RSD Accuracy RSD 0.5100.49 5.69100.50 5.2282.509.405104.98 6.35105.11 6.2089.607.4010
109.54
7.13
109.91
7.01
87.70
1.10
2.2
UP302体外代谢影响因素
考察不同孵育时间、底物浓度和微粒体浓度对
UP302代谢的影响，以此来确定最佳的反应条件。2.2.1孵育时间按“1.5”项下方法孵育后，启动反应并开始计时。分别于温孵0，1，2，3，4，5min ，各吸取20μL 该温孵液，按“1.6”项下方法处理后，取上清10μL 进LC-MS /MS 分析测定。结果代入随行的标准曲线计算得到各个时间点所剩的底物浓度，以剩余底物百分含量对时间做线性回归曲线，即得到孵育时间对体外肝微粒体中UP302代谢的影响关系。
UP302温孵不同时间后的剩余百分含量见图2。微粒体质量浓度为0.2mg ·mL －1，底物浓度为5μmol ·L －1时，底物UP302在0 5min 呈良好的线性消除关系;UP302的剩余百分含量(Y )对孵育时间(t )的线性回归方程为:Y =－11.99t +96.13，r =0.9933。在此条件下，选择线性范围内底物代谢量为30%左右的时间点2min 作为最佳孵育时间，用于酶促反应动力学参数的测定实验。2.2.2
底物浓度加入不同浓度的UP302工作液，按“1.5”项下方法孵育后，其中肝微粒体蛋白质
量浓度为0.2mg ·mL －1
，底物UP302的浓度分别为
1，2，5，10，15，20和30μmol ·L －1，NADPH 浓度为1.1mmol ·L －1，DMSO 浓度不超过0.1%。加入
NADPH 再生系统后立即置于37ħ水浴中震荡温
孵，启动反应并开始计时。分别于0，2min 时各取出20μL 该温孵液，按“1.6”项下处理后，进LC-MS /MS 分析测定。结果代入随行的标准曲线计算得到各个底物浓度时所剩的UP302浓度，以UP302
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