首页 > 学术百科

肝微粒体的提取及其含量测定

人肝微粒体的提取及其含量测定

第一部分：人肝微粒体的提取

一、仪器及试剂：

仪器：内切式匀浆机，高速离心机，超速离心机，表面皿数个，冰袋数个，碎冰，装碎冰烧杯，匀浆用玻璃管，不锈钢剪刀

试剂：含0.15M KCl的100mM磷酸钾缓冲液（PH＝7.4）,100mM磷酸钾缓冲液

材料：8号人肝（称取重量29.95g）

二、实验流程：

组织（记录死亡时间、储运条件）

37度水浴解冻

含0.15 M KCl 的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）漂洗，除去表面血迹及组织液（缓冲液事先已置于冰箱中冷藏）

将组织置于下垫冰块的表面皿中，用剪刀手动剪碎

内切式均浆机匀浆场景建模（过程中注意将组织置于冰块包围住，保持低温环境）

9000 ×g离心20 min，取上清，即得S9

超速离心机105,000 × g 超速离心60 min

取沉淀（过程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，应用吸管将油膜慢慢吸出，而不能倾倒）

重悬于100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中（重悬过程中应注意不要产生气泡）

湖北会计学会

105,000 × g 超速离心60 min

取沉淀，用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）重悬得微粒体（此次重悬时应使用尽量少的缓冲盐体积，以防止微粒体浓度被过于稀释，重悬过程同样注意油膜与气泡）

磷酸盐缓冲液中，分装塑料小管中，-80°C贮存

三、实验结果：

一共称取8号人肝组织29.95g，提取出肝微粒体23mL，经蛋白含量测定，微粒体二次重悬液蛋白含量以牛血清白蛋白计为37.4mg/mL，加入100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释至86mL，得10mg/mL的微粒体储备液，分装保存于-80度待用。

第二部分微粒体中蛋白含量测定

一、仪器和材料：

0.1 N NaOH(2g NaOH溶于500mL水), 1%酒石酸钾（1.342g四水合酒石酸钾溶于100mL

水），2 %无水碳酸钠（溶剂为0.1 N NaOH），0.5 %硫酸酮（溶剂为1%酒石酸钾），甲液（2 %无水碳酸钠50 ml，加0.5 %硫酸酮1 ml，混匀，临用时现配），牛血清蛋白标准液500 μg / ml(溶剂为0.1 N NaOH)

Folin酚(福林试剂)试剂：1份Folin酚原液用蒸馏水稀释3倍得工作液，Folin酚试剂原液配制方法如下：

1000mL磨口回流装置内,加入

钨酸钠(Na2WO4·2H2O)	50 g
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)	12.5 g
蒸馏水	350 mL
85%磷酸	25 mL
浓盐酸	50 mL
文火回流10h。取去冷凝器,加入
硫酸锂(Li2SO4)	25 g
蒸馏水	50 mL
混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜,溶液应呈黄而非绿。若溶液仍有绿,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至500mL, 混合均匀过滤。试剂呈金黄贮于棕试剂瓶内。

二、实验方法：

1、测定原理：

利用Folin酚试剂与蛋白质的酪氨酸与氨酸残基反应在680nm处产生吸收

2、实验过程：

1）样品测定：

试剂	母液浓度	体系浓度	加入体积
H2O	－	－	1mL
HLM	－	－	10μL/5μL
甲液	－	ntfs格式分区－	3mL
混匀，放置10min
Folin酚试剂	－	－	0.8mL
上海地方志混匀，50oC水浴10min或者室温30min
冷水中终止反应

另制备空白一份，不加HLM，按照样品操作程序制作即得

2）标准曲线：

敌菌净

试剂	母液浓度	体系浓度	加入体积
H2O	－	－	(1.00-X)mL
BSA	500μg/mL	－	XmL
甲液	－	－	3mL
混匀，放置10min
Folin酚试剂	－	－	关于加强网络游戏虚拟货币管理工作的通知0.8mL
混匀，50oC水浴10min或者室温30min
冷水中终止反应

X代表各浓度的标准样品加入的BSA体积，从小至大分别为0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6

3）样品检测：

反应完成后，置于680nm处用分光光度计测量吸光度值。

三、实验结果：

1）标准曲线：

Level	加入BSA母液体积mL	蛋白量ug	吸光度值
B	0	0	0.0787	0.0805	0
			0.0823
1	0.1	50	0.2823	0.2839	0.2034
			0.2855
2	0.2	100	0.4361	0.43505	0.35455
			0.434
3	0.3	150	0.5993	0.5857	0.5052
			0.5721
4	0.4	200	0.743	0.75205	0.67155
			0.7611
5	0.5	250	0.8538	0.8671	0.7866
			0.8804
6	0.6	300	0.9539	0.9993	0.9188
			1.0447

本文发布于:2024-09-22 07:35:06，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/xueshu/335194.html

上一篇：拉曼光谱在SiC单晶中的应用

下一篇：甲状腺微粒体抗体(TMA)

标签：试剂微粒体加入置于浓度表面

留言与评论（共有 0 条评论）