医疗保健器具二代测序技术在血液肿瘤中的应用中国专家共识 血液肿瘤是一类具有高度异质性的疾病，其诊疗需要结合形态学、免疫学、遗传学和分子生物学进行综合分析。二代测序（Next-generation sequencing, NGS）作为新的分子生物学技术，具有通量高、灵敏度高、成本低等优势，是探索血液肿瘤的分子发病机制并指导临床诊疗的重要手段。
为推动NGS在血液肿瘤诊疗中的应用，提高诊疗水平，中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会、中华医学会血液学分会、中华医学会病理学分会组织国内相关的血液、病理和检验专家，结合国外权威资料和已积累的大样本数据，制订了NGS在血液肿瘤中应用的中国专家共识。
绝缘子串
血液肿瘤中常见的分子生物学异常主要包括基因突变、融合基因及基因异常表达。 目前NGS在基因突变的检测方面应用最为广泛和成熟，本共识仅涉及基因突变的检测。 一、NGS在血液肿瘤诊疗中的应用价值
1．诊断分型：
基因突变的检测在急性髓系白血病（AML）伴重现性遗传学异常、遗传易感性髓系肿瘤、骨髓增殖性肿瘤（MPN）、骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）、毛细胞白血病（HCL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的诊断中具有关键性的作用，对于其他血液肿瘤则起到辅助诊断的作用。
2．预后判定：
基因突变是各类血液肿瘤预后判断的重要依据，目前NCCN指南已提出了基于基因突变的AML预后分层体系[ 1 ]。此外，MDS、MPN、MDS/MPN、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（CLL/SLL）、LPL/WM、大颗粒淋巴细胞白血病（LGLL）中，已经证实了一些具有明确预后意义的突变基因。其他血液肿瘤中突变基因的预后意义尚有待于进一步研究。
3．指导：
一方面，基因突变检测可提供分子靶点，对应靶向药物进行，目前已有基于突变基因的靶向药物应用于临床或处于临床试验阶段，其中FLT3、IDH1/2、BRAF及JAK-STAT信号通路相关的突变基因已有靶向药物上市；
另一方面，基因突变可以导致对某些药物的敏感或者耐受，及时检测有助于方案的调整。例如，TP53突变的CLL/SLL患者对常规化疗反应差，MYD88和CXCR4基因突变可影响伊布替尼在LPL/WM中的效果，ABL1激酶区突变是慢性髓性白血病（CML）和Ph+ ALL酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐受的主要机制之一。
4．微小残留病（MRD）监测：
基因突变是MRD监测的分子标志物之一。虽然实时定量PCR方法和流式细胞学是目前主流的MRD监测方法，但是由于NGS灵敏度随测序深度加深可进一步提高，在MRD监测方面具有更大的优势。
5．克隆演变：
血液肿瘤在发展过程中会伴随动态的克隆演变，或是基因突变负荷的改变，或是新的突变基因的出现，及时监测基因改变，有助于了解疾病进展并调整方案。
二、基本流程
（一）检测的基因种类列表设计
1．检测的基因：
母语迁移血液肿瘤相关检测基因由临床血液肿瘤专家和实验室专家共同制定，主要依据中国抗癌协会、中华医学会、WHO、NCCN等机构发布的血液系统疾病诊疗指南或者专家共识。对于其他权威文献报道的重要基因，可在验证之后纳入基因列表。
血液肿瘤易感的胚系突变基因，根据检测需求可以纳入，例如CEBPA、DDX41、RUNX1、ETV6、GATA2等基因除了可发生体细胞突变外，发生胚系突变可导致髓系肿瘤的易感。检测基因的数量应在满足临床需求的基础上，综合疾病类型、实验技术、样本数量以及检测成本达到最优化的设计。随着基础及临床研究的不断深入，检测的基因种类亦需随之更新。
2．检测区域：
被检测的基因所覆盖区域可参考临床诊疗指南、权威数据库、文献及实验室自建数据库等。首先应纳入基因热点突变区域或重要结构域的编码区域，例如NPM1基因c.860_863为热点突变区域，NOTCH1基因突变最多见于HD结构域及ΔPEST结构域；无明确热点突变
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区域或突变位点分布比较分散的基因，应检测全部外显子，例如TP53、RUNX1等；剪接位点突变有可能导致外显子跳跃，影响蛋白功能，建议根据数据库记录和文献报道将剪接位点±5 bp的区域纳入检测范围；对于存在非翻译区（UTR）突变的基因，例如BCL6，则应纳入相应区域检测。需要注意的是，对于不能覆盖的热点突变类型或重要区域可通过其他检测方法进行补充，并在检测报告中明确说明。
（二）实验流程
讨论法1．样本采集：
疑诊为血液肿瘤的患者，初诊时应留存新鲜骨髓、外周血或组织样本，以备进行NGS检测，未留存者可使用初诊时的骨髓涂片进行检测。骨髓采集量以1~3 ml为宜，外周血采集量3~5 ml为宜，若白细胞计数偏高或偏低，应适当调整采集量，使单个核细胞总数达到1×107以上。抗凝剂首选EDTA抗凝剂或枸橼酸钠抗凝剂，禁止使用肝素抗凝，推荐24 h内4 ℃冷藏运送。福尔马林固定后的组织标本需选择肿瘤成分，切片厚度8~10 µm，5~8片为宜，常温运输。已染标本不推荐进行NGS检测。条件允许的病例，可从同一患者采取正常组织作为胚系突变对照。
2．DNA提取：
DNA质量是NGS检测成功的关键因素，同一患者的不同病灶组织、不同组织切片应分别单独进行DNA提取，并对DNA质量进行评估，包括浓度、纯度和完整性分析。由于FFPE组织标本以及骨髓涂片所提取的DNA易片段化，且因保存环境及保存时间不同，导致DNA片段化的程度参差不齐，因此各实验室应具有相应的方法检测DNA的完整性或降解程度，并设立明确的合格样本标准。
3．文库制备：
文库制备用于目标区域的富集，主要有杂交捕获法和扩增子建库法，无论采用何种方法制备文库，均需使用已验证过的建库试剂。多标本同时测序应有相应的分子标签用于区分不同的测序标本，明确不同的检测标本和分子标签的一一对应关系；必要时，可对加标签的方法及试剂进行说明。文库浓度过高会导致多克隆数据的产生，降低有效测序数据量；过低会导致整体测序数据的减少，因此在测序之前推荐使用实时定量PCR或其他方法对文库进行定量，将文库浓度调整至合适的水平。每个检测项目应设定其文库质量的要求，并设立明确的合格文库标准。
4．上机检测：
目前测序主要有电位检测和光学检测两种基本原理，检测DNA合成过程中释放的氢离子或荧光信号。为保证测序质量、检测区域覆盖深度及报告时效性，需要根据样本数量和质量选取适当的测序平台和芯片。
郑州 大学（三）生物信息学分析流程
1．质控分析：
由测序平台产生的原始数据通常会存在碱基召回错误、插入删除错误、低质量读段（reads）及接头污染等问题，会在一定程度上影响下游的分析过程。因此，在对测序结果进行具体的生物信息学分析之前，要先对下机数据进行质量评估，制定有效的质量控制标准，包括碱基的质量Q20、目标区域平均测序深度、均一性等评价参数。血液肿瘤的基因突变检测，测序深度应≥500×，平均测序覆盖度、均一性以及在靶率均≥90%。
2．数据过滤：
低质量读段会影响下游的序列处理和分析，因此需要对测序数据进行过滤处理。数据过滤所针对的读段主要有四种：测序质量低的读段（low quality reads），重复读段（duplicate reads），含有核苷酸的插入、删除和替换等错误的读段（insertion/deletion/mismatch）和带有人工污染的读段（adaptor等）。常用的数据过滤软件有Trimmomatic、Fastx_toolkit、NGS QC Toolkit等。
3．序列比对：
当读段经过质控与过滤等步骤达到一定的质量标准之后，需要将其比对到参考基因组上。目前普遍参考的人类基因组参考序列为Human hg19。不同的比对方法根据不同的比对策略设计了不同的算法，常用的比对程序软件有MAQ、BWA、Bowtie/Bowtie2、SOAP/SOAP2、mrFAST和Stampy等，实验室应当选取合适的比对软件，建立完善的实验室比对流程。
4．突变位点注释：
突变位点识别常借助于Samtools、GATK等识别工具。对突变位点的注释内容包括功能信
息、频率信息、软件预测结果信息以及疾病数据库信息，常用的包括Ensembl、RefSeq、GENCODE、dbSNP、1000genomes、ESP、ExAC、COSMIC、HGMD、Clinvar、polyphen和SIFT等。
5．突变位点筛选：
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