p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性(一) 【关键词】,基因,p53；基因,p16；癌,肝细胞Correlationofp53genemutationandp16genedeletionwithhepatocellularcarcinoma西安事变新探【Abstract】AIM:Todetecttheprobabilityofp53genemutationandp16genedeletionintheplasmaofthepatientswithhepatocellularcarcinoma(HCC)andtoexploreitscorrelationwithonsetanddevelopmentofHCCanditsclinicalsignificance.METHODS:PCRwasusedtoamplifyp53geneexon58andtheimmunohistochemistry(SPp16)wasemployedtodeterminethedeletionofp16gene.Thedifferencebetweenthepatientswithorwithoutlivermetastasiswasanalysedingenemutationanddeletion.RESULTS:Of33casesofHLL17(51.55%),showedthemutationofp53;themutationrateinmetastasisgroup(n=18)washigherthanthatinnonmetastasisgroup(n=15).CONCLUSION:ThereisacorrelationbetweenHCCandp53genemutationandp16genedeletion.ThemutationratemayhavethereferencevalueindiagnosisandprognosispredictionofHCC.别姬印象【Keywords】genesp53;genesp16;carcinoma,hepatocelluar【摘要】目的：检测肝癌患者血浆中p53基因突变和细胞核中p16基因缺失的机率，研究与疾病发生、发展的相关性并探讨其意义.方法：实验采用聚合酶联链式反应（PCR）扩增p53基因外显子5~8和免疫组织化学方法SPp16，对其突变和缺失进行分析.结合临床患者有无肝组织以外转移来对比差异性.结果：33例肝癌患者中，有17例结果显示血浆循环核酸p53基因突变；有转移病灶组18例的突变率高于无转移病灶组15例.结论：血浆p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的发生、与疾病的轻重及病灶转移有相关性，突变机率在临床鉴别诊断和预后中有参考价值.【关键词】基因，p53；基因，p16；癌，肝细胞0引言 在各类疾病中，肝癌以恶性程度高、效果差、病灶易转移和给患者带来极大身心损害而排在前列〔1〕.检测血浆中p53和细胞核中p16基因突变机率，对效果判定、康复干预都有参考和使用价值〔2〕，对肝癌的发生和发展的危险因素评估、早期预防提供实验方法学.
1材料和方法
1.1材料收集病例35例，患者均经腹部B超、CT或MRI影像学诊断，CEA,AFP多项肿瘤标志物蛋白检测.有胸腹水患者21例抽取样本进行组织细胞学，4例肝穿刺活检病理学诊断.21例术后证实为肝癌，12例失去手术机会，2例因病情恶化死亡.本组研究实为33例，肝癌无转移15例，肝癌合并肺、胃、肠、脑等部位转移癌18例.男性27例，女性6例，年龄27~69（中位年龄48.27岁）.自静脉采血分离血浆，不受时间、饮食和影响.31例正常对照为献血员血浆，男性20例，女性11例，年龄25~55岁（中位年龄42.93岁）.1.2方法PCR扩增仪使用美国PE公司智能型热循环仪，引物设计参照序列如下〔3〕：p53基因外显子5，扩增第5个显子（P56.1和P5.2）序列上游引物顺序5＇TTCCTCCTGCAGTACC3＇,214bp，上游引物顺序3＇GCCCCAGCTGCTCACCAT3＇；p53基因外显子6，扩增第6个显子（P6.1和P6.2）序列上游引物顺序5＇CACTGATTGCTCTTAGGTCT3＇,144bp，上游引
物顺序5＇AGTTGCAAACCAGACCTCAGG3＇；p53基因外显子7，扩增第7个显子（P7.1和P7.2）序列上游引物顺序5＇TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC3＇,133bp，上游引物顺序5＇CAAGTGGCTCCTGACCTGGA3＇；p53基因外显子8，扩增第8个显子（P8.1和P8.2）序列上游引物顺序5＇CCTATCCTGAGTACTGGTAA3＇,166bp，上游引物顺序3＇GTCCTCCTTGCTTACCTCG3＇.DNA提取方法为静脉血2.5mL，EDTAK2抗凝，混匀后3500r/min离心10min，分离血浆低温-20℃保存.操作程序按DNA提取试剂盒（由博华公司提供QLAmpDNAminikit，Germany）说明书进行.PCR扩增循环条件为：95℃40s，60℃30s，75℃40s，重复循环32次，70℃10min完成延伸反应.再经非变性聚丙烯酰胺凝胶SSCP电泳，银染，应用凝胶自动成像系统分析.阳性（基因突变）条进行基因测序.
免疫组织化学方法采用SP方法，p16单克隆Ab及SP试剂购自成都医药工业总公司.p16蛋白以细胞核染棕兰为阳性，每张切片中以东西南北中五个高倍镜下视野计数，按100%计算.判定标准为阳性细胞数≥5%.阳性对照同批实验对照.
横隔板2结果方俊明
2.1p53基因突变p53基因突变与转移癌的相关性（表1）和p53基因突变分布有区别（表2）.
起死回生术
表1小细胞肝癌（HCC）p53基因突变与转移癌的关系（略）
表217例肝癌患者血浆p53基因热点区外显子突变的分布（略）
2.2p53基因突变相关性分析正常对照血浆31份，结果均为阴性（未发现泳动变位），33例肝癌患者血浆，有17例结果为阳性（有泳动变位）.33例肝癌血浆p53基因有突变的17例（17/33,51.55%），在第8外显子居多（6/17,35.4%）.5~8外显子扩增结果表明，HCCp53基因发生突变的机率在临床有转移的HCC中明显高于无转移的HCC（P0.05）.因此在一定程度上提示出抑癌基因突变与肿瘤发生事件有关，并与肿瘤恶性程度、病情轻重程度有关(χ2=67.33,P0.05).
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