目的 研究1例粘多糖病ⅣA型（mucopolysaccharidosis ⅣA，Morquio A，MPS ⅣA）患者的临床特点及N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）基因的突变。 方法 研究对象为1例散发粘多糖病ⅣA型患儿及50例正常儿童。分别取其外周血5 mL，提取DNA，应用聚合酶链式反应（PCR）扩增GALNS基因的全部14个外显子，应用正反引物对PCR产物进行基因序列直接测序。 结果 该患儿未发现GALNS基因致病突变。但是检测出2个GALNS基因多态性1431A>G、1569+36A>G。 结论 GALNS基因突变不是本研究中1例散发MPS ⅣA患儿的主要致病原因。 标签： 粘多糖病ⅣA型；GALNS基因；突变；分析
粘多糖病（mucopolysaccharidoses，MPS），是由于溶酶体内特定水解酶遗传性缺乏而导致糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）降解代谢障碍，代谢底物堆积，从而引起的一组具有相似表型的遗传代谢病。具体而言，是由体内降解糖胺聚糖的酶缺失或功能缺陷，导致未经完全降解的糖胺聚糖积聚在机体的不同组织，从而产生骨骼畸形、智能障碍等一系列临床症状和体征[1]。目前根据缺陷的酶及受累的代谢底物不同，将粘多糖病分为8型：MPS Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ，每型又分若干亚型。除MPSⅡ型（即Humer综合征）为X连锁隐性遗传外，其余均为常染体隐性遗传[2]。其中MPS Ⅳ型又称Morquio综合征，于1929年由乌拉圭儿科医生Morquio和英国放射学家的Brailsford分别报道，包括MPS cradle 2 the graveⅣA（OMIM 253000）和MPS ⅣB（OMIM256540）两个亚型，分别由N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶（GALNS）和β-D-半乳糖糖苷酶（β-gal）缺乏所致[3]。本组疾病因全身结缔组织均可有过多的粘多糖沉积，故可出现全身各系统的症状，主要表现为身材矮小、面容较丑陋，如表情淡漠、头大、眼裂小、眼距宽、鼻梁低平、鼻孔大、唇厚、前额及双颧突起、毛发多而发际低、颈短、下颌明显、不同程度的智力减退等。有的类型可出现角膜混浊、关节进行性畸形、胸廓畸形、脊柱后凸或侧凸、膝外翻、爪形手、早期出现肝、脾大、耳聋、心脏增大等[4]。根据所缺乏酶的不同，临床表现亦有所差异。本研究对1例散发MPS ⅣA患儿的临床特点及基因研究，结果报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
患儿，男，6岁，发现畸胸3年，身材矮小1年余。2012年7月3日入院，患儿系第1胎第1产，
足月剖宫产出，头先露，出生体重2900 g，身长不详；无窒息史，生后母乳喂养。3个月时会翻身，9个月会走，说话，智力正常。3岁时家长发现前胸隆起明显，给予口服钙剂至今。近一年家长发现患儿生长发育落后于同龄儿，不伴智力低下、异常步态等。患儿父母非近亲婚配，其家族中未发现类似情况。查体：卧位身高101.1 cm，坐高89 cm，体重16.5 kg，身高和体重在同年龄同性别的第3百分位以下。智力正常，眼距宽，塌鼻梁，下颌前突，颈短，鸡胸，助缘外翻，脊柱右侧弯，心、肺、腹（-），四肢未见明显畸形。血Ca：2.43 mmol/L（正常：2.1～2.8 mmol/L），血P：1.62 mmol/L （正常：0.96～1.62 mmol/L），ALP：202 U/L（正常：40～110 U/L）。TSH：4.16 μIU/L（正常：0.17～4.20 μIU/L），FT3：7.77 pmol/L （正常：3.10～6.8 pmol/L），FT4：16.51 pmol/L （正常：10～23 pmol/L）。PTH：26.31 pg/mL （正常：15～65 pmol/L），肝肾功能正常。尿酸性黏多糖定性试验（甲苯胺蓝）阳性。X线检查：第10肋以下肋骨明显变宽，呈飘带样改变。椎间隙正常，椎体变扁，骨密度减低。两侧髂骨翼外展，髂骨体缩短，髋臼不规则，股骨干增粗，干骺端变细，骨质普遍稀疏。参加本研究的50名正常对照儿童，均来自太原地区及周边地区。
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1.2 研究方法
1.2.1 基因组DNA提取 经研究对象同意并签署知情同意书后，各取患儿及对照人（包括患儿父母）外周血5 mL，用TIANGEN公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。
1.2.2 引物设计 由http：///获得GALNS基因的14个外显子序列（NT-010542）及cDNA序列（NM-000512），参考文献[5]及使用primer 3软件设计覆盖GALNS基因14个外显子的14对引物，并委托北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。
口腔科学
1.2.3 PCR扩增 对GALNS基因的所有外显子及其邻近内含子进行PCR扩增，反应体系为25 μL，包括25 mM MgCl2 1.5 μL、10×Taq buffer 2.5 μL、2.5 mM dNTP 2 μL、Taq DNA聚合酶1.25 U、5 pmol/μL正反引物各2 μL、基因组DNA 1 μL。反应条件：预变性94℃ 5min，变性94℃ 1 min，退火58～66℃ 30 s（退火温度由具体引物而定），延伸72℃ 1 min，共35个循环，延伸72℃ 10 min。取PCR产物3 μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染，在GIS凝胶图像处理系统中观察其是否存在及其片段大小。
1.2.4 PCR产物直接测序 以PCR引物作为测序引物，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司对PCR产物进行测序反应。反应结束后，对延伸产物进行DNA序列分析。对测序异常的连云港核废料处理
片段重新进行PCR扩增，正向、反向测序3次，验证结果的可靠性。测序结果应用DNAStar软件包中的SeqmanTM软件及edit Seq软件与正常GALNS基因组序列进行对比，并用http：//bi.v/snp数据库验证。2 结果
对该患儿的GALNS基因全部14个外显子及其部分邻近内含子进行检测，未发现基因突变，但发现出2个SNP：1431A>G、1569+36A>G，这2个基因变异在NCBI属下的基因多态性数据库（SNP库）中已公布。我们还在正常对照组50例健康儿童中检测到了这2个变异。这2个变异均为纯合变异。
3 讨论
MPS ⅣA为一种少见的遗传性粘多糖代谢障碍性疾病，主要导致儿童生长发育迟缓、丑陋面容、骨骼畸形、步态异常、肝脾大、眼角膜混浊等，但智力正常，但也有进行性智力减退的报道。骨的改变包括：鸡胸、脊柱后凸畸形，膝内翻或外翻等。牙的改变主要表现为牙釉质发育不良、牙齿稀疏多形、牙颊面及咬合面点状小凹。该病男女均可发病，男多于女，一般在1岁左右即出现侏儒，3～4岁症状明显。Naoto Yamada等[6]根据临床表现将MPS ⅣA分为轻型、重型和中间型。轻型5岁前生长发育正常，仅有轻度的骨骼异常，一
般无膝外翻、驼背、短肢、短颈等表现，成年身高>150 cm，20岁前生存质量不受影响。重型在3岁半之前即可出现膝外翻、驼背、短肢、短颈等早期症状，成年身高140 cm）、中间型（120～140 cm）和严重型（A，该突变为纯合的错义突变，由于母系单亲二倍体所致。最近Francyne Kubaski等[13]对1例巴西患儿研究又发现了一个新的突变492A>G，但仍需进一步的研究证明基因型与表现型之间是否存在联系。GALNS基因是否还存在新的突变尚未明确。此外，国内对MPS ⅣA的研究并不多，国内MPS 中产教育鄙视链ⅣA患儿是否存在与国外MPS ⅣA患儿相同的突变还有待于进一步研究。
本研究中对1例MPS ⅣA患儿的GALNS基因全部外显子及其部分邻近的内含子进行PCR扩增及DNA序列测序，但未发现任何基因突变，表明GALNS基因突变不是该患儿的主要致病原因。但是，检测到2个SNP：1431A>G、1569+36A>G，其中1431A>G位于外显子13，1569+36A>G位于外显子14以外的非编码区。2011年Sonia Pajares等[14]对14例西班牙MPS ⅣA患者进行GALNS基因分析时也发现了这两个SNP，这2个SNP在NCBI下属的SNP数据库中已公布，均为纯合变异，均不能引起蛋白质发生改变，为GALNS基因多态性[10]。为了明确GALNS基因多态性的发生情况，本研究检测了50名对照人中这2个基因多态性的发生情况，结果显示在50名人中均可检出这2个基因多态性，进一步证实了143
1A>G、1569+36A>G是GALNS基因多态性，与SNP数据库公布的结果一致。
总之，本研究对象未检测出GALNS基因突变，但发现了2个GALNS基因多态性，表明GALNS基因突变不是该患儿的主要致病原因。
[参考文献]
[1] 王云. 单基因遗传病的突变筛查与体外表达系统鉴定[D]. 北京协和医学院硕士研究生毕业论文，2010.
[2] Wibke Müller-Forell，Gudrun Schulze Frenking，Yasmina Amraoui，et al. Mucopolysaccharidoses （MPS）：Clinical and Neuroradiological Aspects of the Different Types[J]. Clinical Neuroradiology，2007，32（1）：143-158.
[3] Catherine Prat，Olivia Lemaire，Johan Bret，et al. Morquio syndrome： Diagnosis in an adult[J]. Joint Bone Spine，2008，75（4）：495-498.
[4] Benedict J.A，Lankestera，Michael Whitehouse，et al. Morquio syndrome[J]. Current Orthopaedics，2006，20（2）：128-131.
[5] L. Carraresi a，R. Parini b，C. Filoni，et al. GALNS gene expression profiling in Morquio A patients’ fibroblasts[J]. Clinica Chimica Acta，2008，397（1-2）：72-76.[6] Naoto Yamada，Seiji Fukuda，Shunji Tomatsu，et al. Molecular heterogeneity in mucopolysaccharidosis IVA in Australia and Northem Ireland：nine novel mutations including T312S，a common allele that confers a mild phenotype[J]. HUMAN MUTATION，1998，11：202-208.
[7] Montano AM，Tomatsu S，Gottesman GS，et al. International Morquio A Registry：clinicalmanifestation and natural course of Morquio A disease[J]. J Inherit Metab Dis，2007，30（2）：165-174.
[8] Emma J Parkinson-Lawrence，Viv J Muller，John J Hopwood，et al. N-Acetylgalactosamine-6-sulfatase protein detection in MPS ⅣA patient and unaffected control samples[J]. Clinica Chimica Acta，2007，377（1-2）：88-91.朱莉娅 吉拉德
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