网络出版时间：２０２０－１０－２３１５：４０ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０７３．Ｒ．２０２０１０２３．０９１７．０１９．ｈｔｍｌ
吴雪芳，李 霜，胡建军，杨迎春，龙艳丽，王 剑，易 韦
摘要：目的 检测结直肠癌组织中Ｋ ＲＡＳ基因突变和ｐ５３蛋白表达，分析两者在结直肠癌中的临床意义及相关性。方法 收集２０１４年１２月～２０１９年４月贵州省人民医院存档的８２例结直肠癌石蜡标本，应用扩增阻碍突变系统ＡＲＭＳ及荧光ＰＣＲ检测Ｋ ＲＡＳ基因突变情况，免疫组化法检测ｐ５３蛋白表达，分析Ｋ ＲＡＳ基因突变和ｐ５３蛋白表达的相关性及其与结直肠癌临床病理特征的关系，并进行术后生存分析。结果 ８２例结直肠癌组织中Ｋ ＲＡＳ基因包括４２例野生型Ｋ ＲＡＳ（５１ ２％）和４０例突变型Ｋ ＲＡＳ（４８ ８％），Ｋ ＲＡＳ基因突变与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移均无关（Ｐ均＞０ ０５）。ｐ５３阴性、弱阳性、强阳率分别为２５ ６％（２１／８２）、１１ ０％（９／８２）、６３ ４％（５２／８２）， ｐ５３表达与淋巴结转移有关（χ２石家庄岳村
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６ ２３７，Ｐ＝０ ０４４），ｐ５３弥漫强阳性时肿瘤更易发生淋巴结转移。Ｋ ＲＡＳ基因突变状态与ｐ
５３蛋白表达无关（Ｐ＞０ ０５）。单因素和多因素生存分析显示，临床分期、Ｋ ＲＡＳ基因类型是影响结直肠癌患者预后的独立因素（
ＨＲ＝２ ７７０，９５％ＣＩ：１ １４８～６ ６８４，Ｐ＝０ ０２３；ＨＲ＝０ ２７６，９５％ＣＩ：０ ０８７～０ ８７４，Ｐ＝０ ０２９）。结论 Ｋ ＲＡＳ、ｐ５３与结直肠癌的发生密切相关，Ｋ ＲＡＳ、ｐ５３可能是两个独立的因素，
ｐ５３与淋巴结转移有关，两者的检测对评估结直肠癌的生物学行为、预后有一定的意义。关键词：结直肠肿瘤；基因突变；Ｋ ＲＡＳ；ｐ５３；免疫组织化学中图分类号：Ｒ７３５ ３ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－７３９９（２０２０）１０－１２１５－０４ｄｏｉ：１０．１３３１５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｃｅｐ．２０２０．１０．０１９
接受日期：２０２０－０６－２６
基金项目：贵州省科学技术基金［黔科合基础（２０１９）１１９３］作者单位：贵州省人民医院病理科，贵阳 ５
纳米氧化铋５０００２作者简介：吴雪芳，女，硕士，主治医师。Ｅ ｍａｉｌ：ｌｉｗｕ８７＠ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ
易 韦，女，主任医师，通讯作者。Ｔｅｌ：（０８５１）８５９２３９１７，Ｅ ｍａｉｌ：ｙｉｗｅｉ６２５２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，其发生是一个多基因、多因素、多阶段参与的过程，涉及癌基因（Ｋ ＲＡＳ等）的激活和抑癌基因（ＴＰ５３、ＡＰＣ等）的失活。Ｋ ＲＡＳ基因突变是结直肠癌形成过程中常见的基因改变，是结直肠癌发生、
发展过程中的重要启动和促进因素［１］。ＴＰ５３基因是癌症发如何提高课堂教学的有效性
聂党权生、发展的关键基因，其在人类癌症中突变率最高。近年有
学者发现ｐ５３蛋白表达与ＴＰ５３基因状态有显著相关性［２］。
免疫组化检测相对基因检测费用低、耗时短、效果佳，因此，临床上常用免疫组化法检测ｐ５３蛋白表达来反应ＴＰ５３基因
突变状态。Ｋ ＲＡＳ和ＴＰ５３基因作为结直肠癌的两种主要突变基因，迄今为止这些基因改变的临
床意义仍有争议，两者在结直肠癌发生过程中的关系尚不清楚。目前关于结直肠癌组织中Ｋ ＲＡＳ基因突变状态与ｐ５３蛋白表达之间关系的研究尚未得到广泛开展和报道。本实验初步探讨了结直肠癌组织中Ｋ
ＲＡＳ基因突变状态和ｐ５３蛋白表达及其与临床病理特征的关系，以及两者表达的相关性及与结直肠癌患者预后的关系。１ 材料与方法
１．１ 临床资料 选取２０１４年１２月～２０１９年４月贵州省人民医院手术切除并经病理确诊的８
２例结直肠癌石蜡标本，其中男性５４例，女性２８例，年龄３２～８９岁，中位年龄５９岁。患者术前均未行放、化疗及生物。所有标本均经两位病理医师分别诊断并行组织学分化程度评估，其中包括高分化１０例，中分化５４例，低分化１８例。根据ＡＪＣＣ第七版指南进行临床分期：Ⅰ期２例，Ⅱ期１０例，Ⅲ期３３例，Ⅳ期３７例。
１．２ 主要试剂 石蜡包埋组织核酸提取试剂盒和人类Ｋ ＲＡＳ基因突变检测试剂盒（荧光ＰＣＲ法）均购自福建厦门艾德生物公司。免疫组化所用浓缩型鼠抗人ｐ５３单克隆抗体（克隆号ＤＯ ７）、ＳＰ染试剂盒及ＤＡＢ显试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。１．３ 方法
暮2
１．３．１ 基因检测 将１０％中性福尔马林固定、石蜡包埋的结直肠癌手术切除标本组织５μｍ厚连续切片，每例组织切３～５张，保证肿瘤细胞含量＞６０％。根据艾德核酸提取试剂盒说明书提取石蜡切片中的ＤＮＡ。采用Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００测定ＤＮＡ浓度，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０应介于１ ８～２ ０之间。根据艾德人类Ｋ ＲＡＳ基因突变检测试剂盒（荧光ＰＣＲ法）检测Ｋ ＲＡＳ基因突变情况。
青春变成鱼尾纹１．３．２ 免疫组化 免疫组化染采用ＳＰ法，操作步骤严格按试剂盒说明书进行，ｐ５３抗体（稀释度１∶１００）孵育前经抗原高压热修复，用已知阳性的癌组织作为阳性对照，ＰＢＳ代替一抗作为空白对照。
１．４ 结果判读 所有病理切片均由两位资深病理诊断医师判读。ｐ５３蛋白表达主要定位于细胞核，以胞核中出现棕褐颗粒为阳性，按染强度和阳性细胞数综合评分：（１）染强度：无阳性着为０分，淡黄为１分，棕黄为２分，棕褐为３分；（２）阳性细胞数：无阳性细胞为０分，阳性细胞数＜５０％为１分，≥５
０％为２分。将两项得分结果相乘：０·
５１２１·临床与实验病理学杂志 ＪＣｌｉｎＥｘｐＰａｔｈｏｌ ２０２０Ｏｃｔ；３６（１０）
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