说明书
【产品名称】
通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）
英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit
【包装规格】
12测试/盒
【预期用途】
KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变
率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床的针对性，降低费用，节省宝贵的时间。 大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物提供参考。
表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变
突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-
A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 532 13-2-A 【检测原理】
本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。【主要组成成份】 试剂盒采用8联PCR管设计，每一个8联PCR管检测一个样品，8联管的1-7(或A-G，或8联PCR管两端各有一个小孔，小孔居侧端为1号管，小孔居中端为8号管)管内装有相应的KRAS基因7种突变检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX（或VIC）信号指示；8（或H）号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示，内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，选择的检测区域是人类KRAS基因相对保守的区段，约100bp，这样即便DNA有降解，外控和内控仍然能够最真实地反
应KRAS基因有效的DNA量。每个PCR反应管内均含有5～10 pM特异性引
物、20 pM双环探针、12.5 μM dNTP s、175 μM氯化镁、1 mM硫酸铵、2.5 mM
氯化钾和纯化水等。（详见表2和表3）
表2 试剂盒组成
试剂盒规格12测试
8联PCR管反应条12条
Taq酶（KRAS）35 μL
KRAS阳性质控品250 μL
表3 8联PCR管反应条的组成
管号检测试剂体积荧光信号
1 A 12-2-A 35 μL FAM，HEX/VIC
2 B 12-2-C 35 μL FAM，HEX/VIC
3 C 12-2-T 35 μL FAM，HEX/VIC
4 或D 12-1-A 3
5 μL FAM，HEX/VIC
5 E 12-1-C 35 μL FAM，HEX/VIC
6 F 12-1-T 35 μL FAM，HEX/VIC
7 G 13-2-A 35 μL FAM，HEX/VIC
8 H 外控35 μL FAM
其它需要自备的试剂和耗材有：
缅甸荡寇志1.石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司的核酸提取试剂
（型号：FFPE DNA，Cat NO. ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德
生物公司的组织、胸水样品DNA分离试剂盒（Cat NO. ADx-TI01）。
2.无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。
3.无DNase和RNase的纯化水。
【储存条件及有效期】
须避光储藏在-20±5℃。有效期为10个月。开瓶后使用不影响产品有效
期。使用完毕后于-20±5℃保存。
试剂盒在运输过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运输，运输时间不超过一周，
运输温度不高于室温。
【适用仪器】
Stratagene Mx3000P™/3005P™、ABI7900HT、ABI7500、ABI StepOnePlus、
ABI7300、LightCycler480、Bio-Rad CFX96。
注意：
①使用ABI仪器时探针模式设置，Reporter Dye：FAM、VIC；Quencher
Dye：TAMRA；Passive Reference：NONE。
②在ABI7900中，本试剂盒仅适用于ABI7900普通机型（非FAST机型），
反应程序模式为标准模式，反应体积选择40 µL，且需要PCR 8联反应条辅助
器（BIOplastics 公司，Cat：7900RAN）。
③适用于LightCycler480Ⅱ代仪器，若需在LightCycler480Ⅰ代仪器上使
用，则必须进行荧光校正。若LightCycler480Ⅱ代仪器也出现荧光交叉现象，
则也需要进行荧光校正，且需要PCR 8联反应条辅助器（BIOplastics 公司，
Cat：B-79480）。
④在使用Stratagene Mx3000P™/3005P™仪器时若发现荧光净升信号
（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应适当降低仪器的增益设置。
⑤有关各仪器的具体设置方法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司
网站资料下载区获得。
⑥PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。
【样本要求】
检测所用DNA的质量非常重要。由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品
往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的
DNA纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样
品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序
收集样品并提取DNA用于检测，客户可根据临床实际样品的情况进行选择。
1.推荐样品类型顺序：新鲜病变组织>冰冻病理切片>石蜡包埋病理组织或切
片。
2.推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA。所提DNA需用紫外分光
光度计测定浓度，其DNA的OD260/OD280在1.8～2.0。提取完的DNA建议立
即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。
3.从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肿瘤病变组织。
4.石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，所取部分尽量在
蜡块中部。
5.所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。
【检验方法】
建议在每次PCR反应中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，
自备纯化水）共同进行分析。
1.取出KRAS阳性质控品和Taq酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。
阳性质控品和Taq酶（KRAS）需快速离心15秒待用。
2.分别向体积均为45 μL的待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水（NTC）
中加入2.25 μL Taq酶（KRAS），涡旋器上混匀15秒，然后快速离心15秒。
（1）根据样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。
新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。
（2）石蜡切片样品的DNA浓度推荐为1.5~3 ng/μL，即每单个反应管添加
的DNA量为7.5~15 ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：
保存不超过三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度
为1.5 ng/µL；保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管
添加的DNA浓度为2 ng/µL；保存年限一年至三年的石蜡切片样品每
单个反应管添加的DNA浓度为2.5~3 ng/µL；不推荐使用保存超过三
年的石蜡切片样品。
气浮
（3）非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.4~1 ng/μL，即每单个反应管添
加的DNA量为2~5 ng。
（4）稀释样品DNA时推荐使用TE（pH8.0）。稀释方法不推荐跨数量级
稀释，即每次稀释倍数控制在10倍以内；稀释时取样量体积不宜小
于5µL，以免稀释后终浓度与预算值有偏差。
3.在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。如发现管盖内侧有液
点，开盖前请先离心。
4.将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入8联PCR反应条中，然
后小心盖上8联PCR管反应条管盖。
注意：加好样品的PCR反应条应立即上机实验；若因特殊原因不能及时上
机反应，应将PCR反应条置于冰水混合物上或4℃冰箱（温度恒定）保存，
保存时间不宜超过12个小时。
5.离心8联PCR管反应条。
6.将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。PCR反应板布局见表4中推荐方法。
7.打开仪器窗口，按照下图中说明的扩增程序图进行设置。
第一阶段：95℃5分钟，1个循环；
第二阶段：95℃25秒，64℃20秒，72℃20秒，15个循环；
第三阶段：93℃25秒，60℃35秒，72℃20秒，31个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX（或VIC）信号，执行实
时PCR，保存文件。
8.实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反应条（使用Mx3000P仪器时应
该待热盖冷却后再处理，以免烫伤，同时可避免由于PCR管盖较热易开造
成污染），并按生物垃圾处理。如非特殊需要，严禁打开PCR管盖，以防造
成污染。
【阳性判断值及检验结果的解释】
1.阴性对照(NTC)的1-7（或A-G）号管的FAM信号应无曲线升起。若7管其
中任一管FAM信号升起，则此次实验结果无效，同时建议重做一次。若1-7
（或A-G）号管的HEX（或VIC）信号及8（或H）号管的FAM信号偶尔升
起，此属正常现象，不影响对突变检测结果的判断。
2.阳性质控品(STD)的Ct值一般小于20，但可能会由于不同仪器的不同阈值
设置而发生波动。
3.确定试验是否成功可信：（1）外控对照反应孔的FAM信号应该升起。若为
石蜡切片样品，则其Ct值应在15～21之间；若为非石蜡切片样品，其Ct值
应在13～19之间。（2）若能满足1）的要求，则继续进行分析。（3）如果
其Ct值小于（1）规定的范围，说明加入的DNA过量，应减少DNA加入量
再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该试验结果仍然可信。
（4）若外控对照分析为阴性或Ct值大于1）规定的范围，说明加入的DNA
含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需要重新提取DNA或增加DNA上样量
再进行试验。但突变信号有升起且落在强阳区，该试验结果仍然可信。（5）
待测样品的内控HEX（或VIC）信号应升起。若内控对照分析为阴性或部
分管分析为阴性，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量不够，需
要重新提取DNA后再进行试验。但如果管内FAM有信号，可能是由于突变
序列的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。
4.Ct值的确定：确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测
表4 PCR仪96 孔板建议布局
名称 1 2 …10 11 12
12-2-A 样品1 样品2 …样品10 STD NTC亚硫酸铵
12-2-C 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
12-2-T 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
12-1-A 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
12-1-C 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
12-1-T 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
13-2-A 样品1 样品2 …样品10 STD NTC
外控样品1 样品2 …样品10 STD NTC
反应管进行检测分析。需要同时选择阳性质控品反应孔、阴性对照孔和样品反应孔，然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处，得到Ct 值。
5.突变结果的确定：首先确定样品各个反应管各自的突变Ct值，然后确定该
样品的外控Ct值。由于样品中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值，把样品检测结果分为阴性、弱阳及强阳。具体判定见表5。
（1）当样品突变Ct值大于或等于阴性临界值时，则该样品为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
（2）当样品突变Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：
a）当某个反应管的突变Ct值小于阳性临界值时，则该样品为该反应管对应的突变阳性，即强阳。
b）当反应管的突变Ct值大于或等于阳性临界值时，则计算该反应管的ΔCt值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值，
则该样品也为该反应管对应的突变阳性，即弱阳；反之则为阴
性或低于本试剂盒的检测下限。
6.ΔCt值的计算：ΔCt值=突变Ct值-外控Ct值。突变Ct值是指样品突变信号
（FAM信号）对应的Ct值；外控Ct值是指样品对应的外控信号（FAM信号）的Ct值。一个样品可能同时含有2个或多个突变类型。
7.某些强阳性样品可能会导致个别突变反应管之间出现交叉信号。当样品在2个或2个以上反应管出现阳性结果（按照表5判读）时，先确定突变反应管中Ct值最小的为真阳性，再计算各反应管的△Ct值（突变Ct值-外控Ct值），并按照表6所列交叉信号阈值来判定其它反应管是否为交叉信号。
（1）若△Ct值小于交叉信号阈值，则认为是真阳性信号，可判为该突变反应管阳性；
（2）若△Ct值大于或等于交叉阈值，则认为是交叉信号，可判为该突变反应管阴性。
dac基因表6 交叉信号阈值表*
交叉真阳性
交叉反应管的阈值
12-2-A 12-2-C 12-2-T 12-1-A 12-1-C 12-1-T 13-2-A
12-2-A - - - - - - 12-2-C - - - 11.12 10.95 - 12-2-T - - - - 11.98 - 12-1-A - - - 9.7 10.97 - 12-1-C - - - - 5.58
- 12-1-T - - - - 12.09 - 13-2-A - - - - - -
备注：“-”表示无交叉反应。
“*”根据人工合成标准品的实验数据获得
【检验方法的局限性】
1.本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者个性化的选择应结合其症
状、体征、病史、其他实验室检查及反应等情况综合考虑。
2.强阳，弱阳区分仅为检测人员提供结果判读方法，其阳性结果区分不能反
映临床意义的变化。
3.阴性结果不能完全排除靶基因突变的存在，样本中肿瘤细胞过少、核酸过
度降解或扩增反应体系中靶基因浓度低于检测限亦可造成阴性结果。
4.肿瘤组织（细胞）可能存在较大异质性，不同部位取样可能会得到不同的
检测结果。
5.不合理的样本采集、转运及处理、以及不当的试验操作和实验环境均有可
能导致假阴性或者假阳性结果。
6.本试剂盒仅用于人类KRAS基因突变的定性检测，不可用于基因分型；仅能
检测本试剂盒所包括的已知基因型，不能检测其他未知分型。
7.该检测仅限于规定的样本类型及检测系统（包括适用机型、核酸提取试剂、
检测方法等）。
8.对于保存年限过久的石蜡组织样品所提取的DNA的检测能力不能按照本
说明书进行。
【产品性能指标】
1.试剂盒外观整洁，标记清晰，无漏液。试剂融化后，无混浊，无沉淀。
2.检测分别含有7种突变类型的7份阳性参考品，阳性参考品符合率100%；
3.检测10份阴性参考品，阴性参考品符合率100%。
4.可以耐受10 ng野生型人类基因组DNA，无非特异；可以检出10 ng DNA样
品中含量低至1%的KRAS基因突变。
5.对同一份精密度参考品进行10次重复，均能检出。
【注意事项】
1.实验前请仔细阅读本说明书。
2.本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运
输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到DNA提取质量、荧光定量PCR
仪型号、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得
出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在
错误、准确性的局限性。
3.实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项。
4.避免在不必要的情况下冻融试剂盒中的试剂。
5.一般DNA用量以10 ng/反应为宜，但对于提取质量较差，应相应增加DNA
用量。尤其是福尔马林固定的石蜡病理样品，因为福尔马林对DNA的交联
作用，该类样品中的DNA较易片段化和降解，虽然紫外分光光度计测量的
浓度DNA较高，但实际加入反应中的有效DNA量并不足够。
6.检测所用DNA的质量非常重要，DNA提取后应进行质控确定提取质量，并
应尽快进行试验，如不能马上进行试验，所提DNA应立即保存在-20℃以
下。
BICYCLOL
7.本试剂盒所有试剂均经过特别配制，以用于上述检测。随意替换试剂盒中
的任何试剂，都可能影响使用效果。不同批号试剂盒成分不可相互混用。
不要使用超过有效期的试剂。
草甘膦母液8.应该严格区分阳性质控品和反应试剂的使用，防止污染试剂，造成假阳
性。
9.实验时注意防止外源DNA对试剂的污染，注意先加完样品DNA后再进行
阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加DNA模板时，使用单独、
专用的移液和滤芯头。进行反应试剂制备的地点应当与添加模板的
地点相隔离。
10.实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器。
11.所有化学药品都具有潜在的危险性。具有PCR实验室上岗证的人员才能使
用本试剂盒。在首次使用本试剂盒前，公司技术支持人员对操作者进行
培训。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护
性措施。产品在正确使用过程中不慎溅入眼内应立即用冲眼器或大量清
水冲洗眼睛。
12.所有检测样本和试剂盒中的阳性质控品应视为具有传染性物质，操作和
废弃物处理均需符合相关法规要求：卫生部《微生物生物医学实验室生
物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
13.临床实验室应严格按照《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》（卫
办医政发〔2010〕194号或现行有效版本）等有关分子生物学实验室、临
床基因扩增实验室的管理规范执行。
【标识的解释】
：保持干燥；：向上；：易碎，小心轻放。
【参考文献】
1.FDA website：v/AboutFDA/CentersOffices/CDER/ucm
172905.htm.
2.McGrath JP, Capon DJ, Smith DH, Chen EY, Seeburg PH, Goeddel DV,
Levinson AD, 1983. Structure and organization of the human Ki-ras
proto-oncogene and a related processed pseudogene. Nature 304 (5926): 501–6.
3.Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, et al. 2006. KRAS mutation status is
predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66
(8): 3992–5.
4.James RM, Arends MJ, Plowman SJ, et al. 2003. KRAS Proto-Oncogene
exhibits tumor suppressor activity as its absence promotes tumorigeneis in
Murine Teratomas. Mol Cancer Res. 1: 820–825.
【基本信息】
注册人/生产企业名称：厦门艾德生物医药科技股份有限公司
地址：厦门市海沧区鼎山路39号
邮编：361027
电话：4000-650-680 传真：0592-*******
网址：www.amoydx E-mail：sales@amoydx
生产许可证编号：闽食药监械生产许第20090237号
【医疗器械注册证编号】国食药监械（准）字2014第3401678号
【产品标准编号】YZB/国5735-2014
表5 结果判定
8联管编号 1 2 3 4 5 6 7 突变名称12-2-A 12-2-C 12-2-T 12-1-A 12-1-C 12-1-T 13-2-A 强阳突变Ct值Ct <26 Ct <26 Ct <26 Ct <26 Ct <26 Ct <26 Ct <26
弱阳
突变Ct值26≤Ct <28 26≤Ct <29 26≤Ct <28 26≤Ct <29 26≤Ct <29 26≤Ct <28 26≤Ct <29 ΔCt Cut-off值9 10 11 10 9 10 9
阴性突变Ct值Ct≥28 Ct ≥29 Ct ≥28 Ct ≥29 Ct ≥29 Ct ≥28 Ct ≥29
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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