本技术提供了一种出入境口岸微生物的快速检验检疫方法方法，属于分子生物学检测鉴定领域，主要包括如下步骤：样本采集；样品制备；高通量测序；生物信息学分析和关联分析五个步骤。该方法基于宏基因组学，可以对出入境口岸微生物的菌结构进行定性和定量检测，灵敏度高、结果准确。 技术要求
1.一种出入境口岸微生物的快速检验检疫方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本统计：统计样本的采集地点、类型和环境特征；
(2)样品制备：从样本中提取总DNA；
(3)高通量测序：利用步骤(2)提取的总DNA构建高通量测序文库，进行高通量测序；
(4)生物信息学分析：步骤(3)获得的测序结果进行聚类注释，获得样品中的细菌种类以及菌结构；
(5)关联分析：将菌结构与环境特征进行关联分析；
(6)评分：利用步骤(5)得到的关联分析结果进行综合评分；
其中，步骤(1)所述样本统计包括：统计样本的采集地点、类型以及以经纬度、是否种植作物、施肥种类
、相关物理、化学、生物指标作为相关指标的环境特征；
步骤(2)所述样品制备依次包括以下步骤：细胞裂解、沉淀蛋白、沉淀DNA、溶解DNA、纯化DNA，最终获得总DNA；
步骤(3)所述高通量测序包括：
S1：根据16S rRNA基因的V3-V4区附近的细菌保守区序列设计带有标签的特异性引物，以步骤(2)提取的总DNA作为模板，PCR扩增获得测序文库；
S2：进行实时荧光定量PCR鉴定步骤S1的扩增浓度，保证测序文库符合上机最低要求；
S3：将S2得到的符合上机浓度最低要求的测序文库进行高通量测序；
所述的步骤S3中，要求最后每个样品的reads数不低于20000条；
所述的高通量测序还包括步骤S4：将步骤S3获得的测序结果进行质量控制、双端连接、去除标签序列和测序引物、去除嵌合体、去除非细菌序列后获得样品中所有的细菌V3-V4区序列；
所述的高通量测序步骤S4中标签序列去除为三段标签拆分；
步骤(4)所述生物信息学分析包括：
S1、去除引物接头，获取样品真实序列；
S2、去除冗余序列，加快分析进度并降低对分析设备硬件的要求；
S3、根据相似性聚类，并与数据库进行比对，获取各序列的注释信息；
重庆师范大学初等教育学院S4、将去除引物接头的序列与聚类结果进行比较，获取每个样品每种菌的具体序列数以及其相对丰度；
步骤(5)所述关联分析包括：
S1、利用统计软件Lefse，通过Kruskal-Wallis秩和检验对不同环境下的物种进行差异分析，确定所有的差异菌种；
S2、利用统计软件Lefse，通过Wilcoxon秩和检验对所有差异菌种进行检验，确定其亚种趋同于统一分类级别；
S3、生成线性分析模型，确定差异菌；
步骤(6)所述评分包括：
S1、通过将大规模常规样品作为对照样品计算其Unifrac矩阵；
S2、基于该矩阵，通过层次聚类获得待测样品的相似性，以绘图形式展现；
S3、根据常规样品矩阵范围作为正常值范围，判断待测样品是否超出该范围，是则视为异常样品。
技术说明书
出入境口岸微生物的快速检验检疫方法
技术领域
施密特触发器仿真本技术属于分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种快速检测出入境口岸微生物方法。
背景技术
自2013年以来，我国已成为世界第一大贸易国，随着国际贸易日益繁荣和多元化，伴随进出口贸易活动发生跨国微生物污染突发事件的风险大幅上升，严重危害公众安全、环境安全和国土安全。同时由于国内微生物领域快速发展，通过邮寄方式寄送微生物菌种的频率和规模都在迅速发展，由邮寄渠道
发生外来微生物入侵的可能性也在不断增长。面对严峻的微生物入侵形势，严密而周全的检疫手段必不可少。为了应对外来微生物入侵，我国先后出台了《人间传染的病原微生物名录》、《检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》以及《动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》等众多检验检疫名录以及相关检疫标准，希冀将可能的微生物入侵阻挡在口岸之外。
然而由于微生物的品种繁多、变异迅速以及人们对于微生物的认知不足，经常会有较为迅猛的外来致病菌疫情从国外蔓延至国内。如2016年2月9日，确诊了中国大陆首例输入性寨卡病毒感染病例；2016年7月，北京口岸发现了我国首例输入性裂谷热病例；2018年8月，辽宁沈阳确诊首例非洲猪瘟疫情等不一而足。这些事件意味着我国需要不断在新的形势下更新微生物检验检疫手段，将危险扼杀与萌芽之前。
当前我国的主要的微生物检验检疫手段是以富集培养，分离、鉴定、动物感染实验以及理化分析等传统描述型手段为主，部分特定菌或病毒采用分子生物学手段进行鉴定。
对于传统的描述性手段，由于菌种的不同，需要采取不同的检测方案。如大肠杆菌的检测需要通过乳糖蛋白胨发酵实验以及革兰氏染等手段进行；而对于弧则需要碱性蛋白胨水增培养基进行增殖、TCBS琼脂和CHROMIDVIBRIO弧菌显培养基进行分析纯化，镜检后再培养并通过细菌鉴定仪鉴定；对于肠球菌则是另一套检测方案。综上所述，传统的鉴定方法存在着耗时长、操作繁琐、灵敏
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度低以及容易漏检等缺陷，这意味着将分子生物学手段引入检验检疫，构建全面而严密的检验检疫手段的重要性大大提升。
目前口岸检验检疫中运用的分子生物学手段主要有聚合酶链式反应(PCR)、核酸杂交以及生物芯片等手段。这些手段相较于传统手段，更加灵敏、特异以及快速。对于PCR而言，通过同时引入多种特异性引物同时检测多种病原体，包括普通PCR、反转录PCR、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD技术、荧光定量PCR、随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)等。通过PCR手段进行检测的主要有分支杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、螺旋体以及大多数病毒；核酸杂交法主要用于无法培养且无诊断抗原的病毒，主要包括荧光原位杂交、斑点杂交等；生物芯片主要运用于检测大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌及分支杆菌的分型及耐药性突变等。
以上三种运用较为广泛的分子生物学手段尽管拥有比传统手段更为宽广的适用范围，但仍然并非对于所有微生物普遍适用。而随着高通量测序的发展以及宏基因组学的快速进步，其成本及检出限在不断降低，且随着生物信息学的发展其检测准确性在不断提高。这意味着将宏基因组相关手段引入口岸微生物检验检疫体系是一个很好的选择。
江南命案中国专利201810879060.3申请中介绍了一种液相芯片技术检测微生物的方法，包括以下步骤：S1，
根据微生物基因序列设计合成对应的布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针；S2，将S1中各探针分别与第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球相连，分别获得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液；S3，将待测物样品，经DNA 抽提和PCR扩增获得待测PCR产物，将待测PCR产物加入偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，与阈值比较，判断待测物样品为阴性或阳性。该技术虽然能通过高通量检测技术检测多种微生物，但只能对微生物的有无进行定性的判定，无法完成定量分析。
中国专利201810372651.1申请中介绍了一种快速筛查食源性病原菌的方法，属于食品安全检测技术领域。所述食源性病原菌快速筛查方法基于细菌特异性酶反应，反应体系包括支持目标菌生长的营养成分、干扰菌抑制剂及细菌特异性酶试卤灵类反应底物，测试时通过将定量测试样品放入反应体系中，在适宜温度下培养5～8h，直接观察反应体系中的颜变化或在573nm波长激发后，检测585nm处荧光的产生与否即可获得食源性病原菌定性检测结果。但该技术使用的是直接培养方法，检测时间长，该技术检测结果的准确性易受培养过程的影响。
技术内容
本技术的目的在于基于宏基因组学，提供一种快速检测出入境口岸微生物方法。
本技术所述的检测方法，包括样本统计、样品制备、高通量测序、生物信息学分析、关联分析和评分
六个步骤。
1、样本统计：统计样本的采集地点、类型和环境特征；
2、样品制备：从样本中提取总DNA；
3、高通量测序：利用步骤2提取的总DNA构建高通量测序文库，进行高通量测序；
4、生物信息学分析：步骤3获得的测序结果进行聚类注释，获得样品中的细菌种类以及菌结构；
5、关联分析：将菌结构与环境特征进行关联分析；
6、评分：利用步骤5得到的关联分析结果进行综合评分。
其中，步骤1样本统计包括：统计样本的采集地点、类型以及经纬度。
其中，步骤1样本统计包括：采集样品是否为种植作物、施肥种类、相关物理、化学、生物指标作为环境特征指标。
其中，步骤2样品制备包括：细胞裂解、沉淀蛋白、沉淀DNA、溶解DNA和纯化DNA五个步骤。
具体的，根据样品类型选择DNA提取试剂盒进行样品制备。
其中，步骤3高通量测序包括：构建高通量测序文库构建和进行高通量测序两个步骤。
具体的，包括以下三个步骤：
(1)根据16S rRNA基因的V3-V4区附近的细菌保守区序列设计带有标签的特异性引物，以步骤2中提取的总DNA作为模板，PCR扩增获得测序文库；
(2)进行实时荧光定量PCR鉴定步骤(1)的扩增浓度，保证测序文库符合上机最低要求；
(3)将步骤(2)得到的符合上机浓度最低要求的测序文库进行高通量测序。
具体的，步骤(3)中每个样品的reads数不低于20000条。
具体的，对高通量测序结果进行质量控制、双端连接、去除标签序列和测序引物、去除嵌合体、去除
非细菌序列后获得样品中所有的细菌序列，将获得的细菌序列进行聚类注释，获得每个样品中的细菌种类以及菌结构。
深圳书城培训中心具体的，标签去除为三段标签序列的拆分。
其中，步骤4生物信息学分析包括：
(1)去除引物接头，获取样品真实序列；
(2)去除冗余序列，加快分析进度并降低对分析设备硬件的要求；
(3)根据相似性聚类，并与数据库进行比对，获取各序列的注释信息；
(4)将去除引物接头的序列与聚类结果进行比较，获取每个样品每种菌的具体序列数以及其相对丰度。
其中，步骤5关联分析包括以下三个步骤：
(1)利用统计软件Lefse，通过Kruskal-Wallis秩和检验对不同环境下的物种进行差异分析，确定所有的差异菌种；
(2)利用统计软件Lefse，通过Wilcoxon秩和检验对所有差异菌种进行检验，确定其亚种趋同于统一分类级别；
(3)生成线性分析模型，确定差异菌。
网上杂志其中，步骤6评分包括以下三个步骤：
(1)通过大规模常规样品(对照样品)计算其Unifrac矩阵；
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