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荧光蛋白作为标记分子在生物医学的研究中发挥了重要作用，涉及分子水平、细胞水平乃至动物活体成像。动物体内的环境错综复杂，光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收（可见光范围350~600nm和红外线范围>900nm），光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射。在可见光激发光源下，组织还会产生自发荧光，这些自发荧光主要来源于皮毛（黑素，发光光线波长峰值500~520nm）和血液（血红蛋白，发光光线波长峰值504~540nm）。因此，对于活体成像技术，大家最关心的问题还是如何提高灵敏度，即提高信噪比，降低体内组织吸收，消除脂肪皮毛等带来的背景荧光。 虾球转
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大家比较熟悉的是绿荧光蛋白（GFP）、红荧光蛋白（RFP），但是用于激发它们的光波很容易被组织吸收，即组织穿透力比较弱，而且它们所在波长范围内组织的自发荧光比较强，即背景比较高。这些因素导致GFP、RFP为代表的可见荧光蛋白，在体内的灵敏度有限，限制了使用范围。
近红外（NIR）荧光蛋白（FP），是来自细菌光敏素光感受器（bacterial phytochrome photoreceptors，BphPs）的荧光蛋白（FP）。相比GFP、RFP，
它们的激发和发射光谱位于最有利于光穿透组织的“光学窗口”（~650-900nm），具有低细胞自发荧光，光散射减少，血红蛋白、黑素和水的吸收最小，更适宜于动物活体组织的深层成像，是深层成像更为理想的标记分子。除了体内成像应用，NIR FPs还用于研究光遗传蛋白相互作用，设计用于多模态成像的嵌合荧光素酶，以及用于多参数光声层析成像的探针。
BphP衍生的FPs的NIR光谱性质取决于这些蛋白质利用血红素代谢产物BV （biliverdin IXa，胆绿素）作为发团的能力。BV在所有哺乳动物细胞中大量存在。国际标准视力表
对于新一代的NIR FPs，它们的野生型模板，光谱和生化特性有所不同。（1）单体NIR FP，命名为mIFP。来自慢生根瘤菌属的BrBphP。（2）几种具有不同光谱性质的单个miRFP，来自红假单孢菌的
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工业反哺农业RpBphP1。所有这些NIR FPs共享共同的结构折叠，并由共34.5kDa的两个BphP结构域（称为PAS和GAF）组成。（3）最后一种NIR FP，称为smURFP，来自赤藓红细菌蓝细菌的别藻蓝蛋白a亚基（APCa），其为32.0kDa二聚体。虽然野生型APCa结合生物素生成素，但是smURFP的定向进化使其能够结合BV。
由于NIR FPs的荧光取决于BV发团，所以在哺乳动物细胞中需要跟内源性BV有效和特异性结合来产生亮的荧光。哺乳动物细胞中NIR FPs的亮度（也称为有效亮度）取决于分子亮度，其是在蛋白质表达水平、折叠和稳定性以及细胞BV水平及其结合特征上的摩尔消光系数和量子产率的产物。
本文中，作者Shemetov等系统比较了常用的活体哺乳动物细胞系如Hela，HEK293，COS-7，U87和U-2 OS中的smURFP，miRFP670，mIFP和miRFP703的有效亮度。smURFP和miRFP670是荧光最大值为670 nm的蓝移NIR FPs。mIFP和miRFP703是荧光最大值约为703 nm的红移NIR FPs。结果发现在所有测试的活细胞中，miRFP670在NIR FPs中表现出最高的荧光信号。
血红素加氧酶（HO）催化血红素降解，产生BV等。在哺乳动物中，HO具有三种主要的同工型，HO1可被氧化应激诱导，HO2是组成型，HO3是HO2的假转录。有研究报道，不管是集胞藻蓝细菌HO还是人HO的共表达，能显著增强哺乳动物细胞中几种NIR FPs的荧光。
由于一些NIR FPs在哺乳动物细胞中显示出低荧光，作者通过共同表达HO来观察是否能增强荧光。结果发现，HO1的共表达仅稍微增强了基于BphP的NIR FPs 的有效亮度，并且对smURFP细胞亮度没有影响。同样，与血红素前体（5-ALA，FeSO4）的孵育也没有增加NIR FPs的有效亮度，甚至升高了细胞自体荧光。
接下来，通过补充外源性发团（如25 mM BV或5 mM BVMe2），观察对NIR FPs的有效亮度的影响。发现BV或BVMe2显着增强smURFP的有效亮度，与此同时，增强了细胞自发荧光。相比之下，只有BV使 miRFP670和miRFP703的细胞荧光增加了2倍（这种增强相当有限），而BVMe2导致其有效亮度降低。说明，在哺乳动物细胞中，这些蛋白质初始分子工程的质量是确定NIR FPs亮度的关键因素，而不是内源性BV发团的量不足。
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由于BphP衍生的miRFP670，mIFP和miRFP703已经表现出与内源性BV发团的有效结合，因此，
这些NIR FPs的未来工程研究工作应该集中在增加其量子产率，例如通过减少各种激发态失活途径。相比之下，APCa衍生的smURFP 应进一步改进以显著增强其在哺乳动物细胞中结合内源性BV发团的效率和特异性。
目前，miRFPs是最佳的NIR FPs，因为其具有最高的有效亮度和光谱分离，使得它们脱颖而出。
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