论㊀
㊀著
（基础研究）
吴章泽，王一芳，王正伟，陈㊀昌
㊀㊀［摘要］㊀目的㊀观察人参皂甙Ｒｈ２对人胶质瘤细胞内钙离子浓度的影响㊂㊀方法㊀实验分为对照组和人参皂甙Ｒｈ２组，对照组应用常规培养基培养人胶质瘤细胞株Ｕ８７ＭＧ，人参皂甙Ｒｈ２组在常规培养基中人参皂甙Ｒｈ２的浓度为２０μｇ／ｍＬ，
利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测各组培养的人胶质瘤细胞内钙离子浓度，再利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测人胶质瘤细胞Ｃａｖ１．２蛋白的表达，最后利用膜片钳技术检测人胶质瘤细胞Ｌ型电压依赖型钙离子通道的功能㊂㊀结果㊀人参皂甙Ｒｈ２处理Ｕ８７ＭＧ细胞后，细胞内钙离子浓度是对照组的２．５倍（Ｐ＜０ ０５）；人参皂甙Ｒｈ２培养后胶质瘤细胞Ｃａｖ１．２蛋白表达量是对照组的１．５倍（Ｐ＜０ ０５），且Ｌ型电压依赖性钙离子通道功能增强㊂㊀结论㊀人参皂甙Ｒｈ２可通过增加胶质瘤细胞Ｃａｖ１．２表达和Ｌ型电压依赖性钙离子通道的功能促进细胞内游离钙离子浓度
的增加，从而诱导人胶质瘤细胞的凋亡㊂㊀㊀［关键词］㊀人参皂甙Ｒｈ２；人胶质瘤细胞；细胞内钙离子浓度；Ｌ型电压依赖性钙离子通道；Ｃａｖ１．２㊀㊀［中图分类号］㊀Ｒ３４㊀㊀㊀［文献标志码］㊀Ａ㊀㊀㊀［文章编号］㊀１６７２⁃２７１Ｘ（２０１９）０１⁃００１２⁃０５㊀㊀［ＤＯＩ］㊀１０ ３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２⁃２７１Ｘ．２０１９．０１．００３㊀
作者单位：２１０００２南京，东部战区空军医院神经科（吴章泽㊁王一
芳㊁王正伟㊁陈㊀昌）
通信作者：王一芳，Ｅ⁃ｍａｉｌ：５２３０１０４５０＠ｑｑ．ｃｏｍ
ＲｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２ｏｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ
ＷＵＺｈａｎｇ⁃ｚｅ，ＷＡＮＧＹｉ⁃ｆａｎｇ，ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ⁃ｗｅｉ，ＣＨＥＮＣｈａｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ＡｉｒＦｏｒｃｅＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＥａｓｔｅｒｎＴｈｅａｔｅｒＣｏｍｍａｎｄ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００２，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）㊀㊀［Ａｂｓｔｒａｃｔ］㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆ
ｆｅｃｔｏｆｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２ｏｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉ⁃
ｏｍａｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍ．㊀Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＨｕｍａｎＵ８７ＭＧｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｕｍ（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）ａｎｄｉｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ２０μｇ／ｍＬｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）．Ｗｅｔｅｓｔｅｄｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｖ１．２ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｔｈｅＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＡｎｄｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬ⁃ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｐａｔｃｈｃｌａｍｐ．㊀Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２ｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ，ｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｖ１．２ａｎｄｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬ⁃ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ．㊀Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＧｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２ｉｎｃｒｅａ
ｓｅｓｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓｂｙｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣａｖ１．２ａｎｄｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＬ⁃ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ．
㊀㊀［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］㊀ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅＲｈ２；ｈｕｍａｎｂｒａｉｎｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓ；ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ；Ｌ⁃ｔｙｐｅｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ；Ｃａｖ１．２
０㊀引㊀㊀言
脑胶质瘤是中枢神经系统中发病率最高的恶性肿瘤［１⁃２］㊂由于其生长呈浸润性且与周围正常组织分界不清，即使是当代的神经外科技术操作也难以做到将肿瘤在病理学上完全切除，因而胶质瘤的
复发率极高，且胶质瘤随着复发次数的增加，其恶性程度亦增加［３⁃４］㊂因此，研究脑胶质瘤的分子机制㊁发现的新型药物有重要意义㊂大量研究表明，作为细胞内第二信使的钙离子在细胞的增殖㊁凋亡等过程中发挥重要作用，而Ｌ型电压依赖性钙离子通道（Ｌ⁃ｔｙｐｅｖｏｌｔａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ，ＬＴＣＣ）是钙离子进入胶质瘤细胞的主要方式［５⁃６］㊂人参皂甙Ｒｈ２是人参中的天然成分，其具有脂溶性，极易通过血脑屏障［７⁃８］㊂本研究通
过人参皂甙
Ｒｈ２体外培养的人胶质瘤细胞，利用流式细胞仪等手段检测细胞内钙离子浓度，进而探究其机制㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀材料㊀ＤＭＥＭ细胞培养基㊁胎牛血清等细胞培养试剂（Ｇｉｂｃｏ公司）；人胶质瘤细胞株Ｕ８７ＭＧ（中科院上海细胞库）；膜片钳信号采集设备（ＮｉｈｏｎＫｏ⁃ｈｄｅｎ，ＣＥＺ⁃２３００）；人参皂甙Ｒｈ２（南京世洲生物科技公司）；激光共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ５）；流式细胞仪（美国Ｂ＆Ｄ公司）；尼菲地平㊁ＢａｙＫ８６４４和Ｃａｖ１．２抗体（以列Ａｌｏｍｏｎｅ公司）；荧光标记钙离子探针Ｆｌｕｏ⁃３ＡＭ（中国碧云天公司）㊂
１．２㊀方法
１．２．１㊀细胞培养㊀细胞的培养环境为３７ħ，５％ＣＯ２孵箱内培养㊂取第５ １０代Ｕ８７ＭＧ细胞株用于实验㊂实验分为对照组和人参皂甙Ｒｈ２组，对照组应用常规培养基培养细胞，人参皂甙Ｒｈ２组在常规培养基中人参皂甙Ｒｈ２的浓度为２０μｇ／ｍＬ，作用时间为４８ｈ㊂
１．２．２㊀钙显像检测Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度㊀利用Ｆｌｕｏ⁃３ＡＭ对Ｕ８７ＭＧ细胞内游离钙离子标记，ＰＢＳ洗涤细胞，３７ħ孵箱孵育３０ｍｉｎ，再次用预冷的ＰＢＳ洗涤细胞３次，
参照说明设置激光共聚焦显微镜参数㊂在共聚焦显微镜视野中选取５０个细胞并检测细胞内的荧光强度，并利用激光共聚焦显微镜自带软件进行数据分析㊂
１．２．３㊀流式细胞仪检测Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度㊀将Ｕ８７ＭＧ细胞制备成流式细胞仪合适的细胞悬液，利用上述方法标记Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子，调节细胞数量至２ˑ１０６／ｍＬ，上流式细胞仪检测㊂激发条件为：发射波长为５２５ｎｍ，激发波长为４８８ｎｍ㊂利用ＥＸＰＯ３２和ＦＡＣＳＤｉｖａ软件对检测数据进行分析㊂
１．２．４㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｕ８７ＭＧ细胞Ｃａｖ１．２含量㊀ＬＴＣＣ是钙离子进入Ｕ８７ＭＧ细胞的主要通道㊂为了探究人参皂甙Ｒｈ２增加Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子的原因，利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术检测Ｕ８７ＭＧ细胞膜上ＬＴＣＣ核心蛋白Ｃａｖ１．２表达㊂制备Ｕ８７ＭＧ细胞的蛋白样本，并绘制标准曲线；将上述成功制备的蛋白样本煮沸后电泳，条件设置为９０Ｖ，持续３０ｍｉｎ，随即更改电泳条件为１２０Ｖ，继续电泳９０ｍｉｎ；转膜时设置条件２５０ｍＡ恒流２ｈ；按照抗体说明书孵育一抗４ħ过夜，孵育二抗后进行ＥＣＬ发光进行半定量分析㊂
１．２．５㊀膜片钳全细胞模式记录Ｕ８７ＭＧ细胞Ｌ型电压依赖型钙离子通道电活动㊀为了进一步探究人参皂甙Ｒｈ２增加Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度的原因，我们利用膜片钳技术检测人参皂甙Ｒｈ２对Ｕ８７ＭＧ细胞上ＬＴＣＣ功能的影响㊂利用垂直拉制法制备接触细胞用玻璃微电极，根据Ｕ
８７ＭＧ细胞内液的成分和Ｌ型电压依赖型钙离子通道的特性，配制玻璃微电极内外液体，电极内液配方为（ｍｍｏｌ／Ｌ）１５０ＣｓＣｌ㊁１０ＨＥＰＥＳ㊁５Ｎａ２ＡＴＰ㊁５ＥＧＴＡ和１０Ｄ⁃葡萄糖，ｐＨ用
沈阳建筑大学图书馆
ＣｓＯＨ调整到７．２；制备外液１和外液２，其配方分别是外液１（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１２０ＮａＣｌ㊁０ １％ＢＳＡ㊁３０ｍａｎｎｉｔｏｌ㊁３０ＨＥＰＥＳ㊁３Ｋ２ＨＰＯ４㊁０ ５％葡萄糖和１ＭｇＳＯ４，用ＮａＯＨ将ｐＨ调整至７．４；外液２（ｍｍｏｌ／Ｌ）：１０ＨＥＰＥＳ和１０８ＢａＣｌ２，用Ｂａ（ＯＨ）２将ｐＨ调整到７．６㊂高阻封接后保持电阻在２ＧΩ以上，随后进行电击或者吸引破膜㊂先利用ＬＴＣＣ特异的激动剂（ＢａｙＫ８６４４）和阻断剂（尼菲地平）处理后检测单个细胞的电流水平，明确上述方法检测到的电流为ＬＴＣＣ产生的电流㊂进一步再检测２组多个细胞的电流强度变化㊂１．３㊀统计学分析㊀利用ＳＰＳＳ１６．０统计软件进行相关数据分析，计量资料以均数ʃ标准差（ ｘʃｓ）表示，首先进行数据正态性分析和方差齐性的检验，两样本间比较采用独立ｔ检验；不同时间点多次测量的样本分析采用重复测量方差分析，组间比较采用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｐｏｓｔｈｏｃ检验，以Ｐɤ０ ０５为差异有统计学意义㊂
２㊀结㊀㊀果
２．１㊀钙显像技术和流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度㊀与对照组比较，人参皂甙Ｒｈ２组荧光强
度明显增高㊂人参皂甙Ｒｈ２处理后Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度是对照组Ｕ８７ＭＧ的２．６倍（Ｐ＜０ ０５），见图１㊂流式细胞仪结果显示：与对照组比较，人参皂甙Ｒｈ２组荧光强度明显增高（Ｐ＜０ ０５）㊂见图２㊂２．２㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞Ｌ型钙离子通道的核心蛋白Ｃａｖ１．２的表达量㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示：人参皂甙Ｒｈ２能够上调Ｃａｖ１．２的蛋白表达（Ｐ＜０ ０５），见图３㊂
与对照组比较，∗Ｐ＜０ ０５
图１㊀钙显像技术检测Ｕ８７ＭＧ
细胞内钙离子浓度
与对照组比较，∗Ｐ＜０ ０５
图２㊀流式细胞仪检测Ｕ８７ＭＧ
细胞内钙离子浓度
与对照组比较，∗Ｐ＜０ ０５
图３㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各组细胞中Ｌ型钙离子通道的核电视互联网化
心蛋白Ｃａｖ１．２的表达量
２．３㊀膜片钳检测细胞ＬＴＣＣ电流强度㊀人参皂甙Ｒｈ２处理后Ｕ８７ＭＧ细胞上ＬＴＣＣ电流增强（Ｐ＜０ ０５），且在加入此离子通道特异性激动剂Ｂａｙ
Ｋ８６４４后人参皂甙Ｒｈ２组和对照组的钙离子电流强
度均增加，但人参皂甙Ｒｈ２组钙离子电流强度增加的幅度更大（Ｐ＜０ ０５）㊂见图４㊂３㊀讨㊀㊀论
虽然目前胶质瘤的是积极的手术㊁放㊁化疗等联合措施，但胶质瘤复发率极高，且随着复发次数的增加，其恶性程度亦增加，患者预后极差㊂研究表明，ＷＨＯ分级３级的胶质瘤患者的平均生存期在４年左右，恶性程度较高的胶质母细胞瘤患者平均生存期为１２ １５个月㊂因此，寻胶质瘤新靶点具有重要意义［９⁃１１］㊂人参皂甙Ｒｈ２
相对分子质量小，且为脂溶性容易通过血脑屏障在颅内发挥作用［７⁃８］㊂有研究表明人参皂甙Ｒｈ
２可通过激活Ｃａｓｐａｓｅ通路促进肝细胞的凋亡，并伴有细胞周期的改变［１２］㊂研究证实人参皂甙Ｒｈ２抑制Ｃ６胶质瘤细胞的增殖并可诱导胶质细胞瘤
的凋亡［７］㊂作为细胞内第二信使的钙离子在细胞的增殖㊁凋亡等过程中发挥重要作用［１３］㊂而细胞内过多的钙离子引起钙超载，后者又是引起细胞凋亡的重要机制㊂
ａ：对照组；ｂ：人参皂甙Ｒｈ２组；ｃ：无钙离子通道调节剂作用；ｄ：Ｌ型钙离子通道特异性激动剂作用与对照组比较，∗Ｐ＜０ ０５㊁＃Ｐ＜０ ０５
图４㊀膜片钳全通道技术检测细胞Ｌ型电压依赖性钙离子通道电流强度
㊀㊀本实验中，我们利用Ｆｌｕｏ⁃３ＡＭ标记Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子，分别利用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度，我们发现人参皂甙Ｒｈ２处理后，Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度增加㊂研究证实大多数细胞内游离钙离子有两个来源，即外钙内流和内钙释放，前者主要是指细胞外的钙离子通过钙离子通道进入细胞内，而细胞表面的钙离子通道主要指的是ＬＴＣＣ［６］；后者主要是指细胞内部内质网等细胞器的释放，但细胞器中钙离子的释放主要是通过细胞器表面Ｒｙ受体等形式释放，可使得细胞内的钙离子在短时间内大幅提升［１４⁃１５］㊂而本实验中，Ｕ８７ＭＧ细胞内的钙离子浓度持续保持较高水平，未检测到短时间内大幅度的细胞内钙离子浓度波动，故我们将ＬＴＣＣ作为机制探究的重点㊂
为了进一步探究人参皂甙Ｒｈ２增加Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度的原因，我们围绕Ｕ８７ＭＧ细胞ＬＴＣＣ分别利用免疫印迹技术和膜片钳技术检测ＬＴＣＣ相关特性，发现Ｕ８７ＭＧ细胞上ＬＴＣＣ的核心蛋白Ｃａｖ１．２表达增加，且ＬＴＣＣ在人参皂甙Ｒｈ２处理后功能增强㊂ＬＴＣＣ的功能受到多种因素的影响，主要包括通道的数量和单个通道的功能［１２］，本实验中Ｃａｖ１．２表
达增加可能是ＬＴＣＣ功能增强的原因之一㊂通过本实验我们认为，细胞外游离钙离子通过ＬＴＣＣ进入细胞很可能是人参皂甙Ｒｈ２处理后Ｕ８７ＭＧ细胞内钙离子浓度增加的一个重要原因㊂综上所述，人参皂甙Ｒｈ２可通过增加Ｕ８７ＭＧ细胞通道核心蛋白Ｃａｖ１．２表达和ＬＴＣＣ的功能促进细胞内游离钙离子浓度的增加㊂本实验探讨了人参皂甙Ｒｈ２对Ｕ８７ＭＧ细胞内游离钙离子浓度的影响及其可能的机制，但人参皂甙Ｒｈ２促进Ｕ８７ＭＧ细胞内游离钙离子浓度升高的原因和人参皂甙Ｒｈ２诱导Ｕ８７ＭＧ细胞凋亡的其他机制仍有待进一步研究与探索㊂
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ｏｖｅｒｌｏａｄ／ＸＯ／ＲＯＳ／ｍＰＴＰｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．ＲｅｄｏｘＢｉｏｌ，２０１８，１６
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文件加密存储
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ｃｈｅｍ，２０１８，８７（４）：３２９⁃３５２．
［１５］㊀ＫｏｌｂＩ，ＳｔｏｙＷＡ，ＲｏｕｓｓｅａｕＥＢ．Ｃｌｅａｎｉｎｇｐａｔｃｈ⁃ｃｌ健康快线
ａｍｐｐｉｐｅｔｔｅｓｆｏｒｉｍｍｅｄｉａｔｅｒｅｕｓｅ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ，２０１６，１１（３）：３５００１．
（收稿日期：２０１８⁃０３⁃１６；㊀修回日期：２０１８⁃１２⁃０９）
（责任编辑：叶华珍；㊀英文编辑：朱一超）
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