王陈汉;孙文博;刘宇驰;阎华;钱春发;肖红;刘宏毅
【摘 要】目的 探讨建立人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,为个体化研究临床胶质瘤细胞的特性提供材料.方法 采用组织块培养法,在培养皿中,经历种植、培育、提取等步骤,获得胶质瘤原代细胞,并采用划痕实验测试其迁移能力,Trans-well小室实验测试其侵袭能力.结果 组织块培养法成功培育了胶质瘤原代细胞;并且培育出的胶质瘤原代细胞具有良好的迁移能力和侵袭力.结论 本实验方法培养的人脑胶质瘤原代细胞可用于个体化研究临床胶质瘤细胞的特性.%Objective To set up the method for the primary culture of human brain glioma cells and provide materials for individualized study in the cell characteristic of clinical glioma.Methods The tissue pieces culture method is adopted,in a culture dish,experience of planting,he primary glioma cells were extracted,and we take the wound-healing assay (WHA) method to test the migration ability,Trans-well culture chamber system to test the invasion ability.Results Tissue culture method has successfully cultivate the primary glioma cells,and these primary glioma cells have a better ability in migration an霜叶红于二月花是什么植物
d aggressivity.Conclusions The primary glioma cells cultured by the tissue pieces culture method can be used to the individualized study in the cell characteristic of clinical glioma.
2014sci影响因子【期刊名称】《临床神经外科杂志》
【年(卷),期】2017(014)002
希网网络
【总页数】4页(P95-97,101)
【关键词】胶质瘤;原代培养;迁移;侵袭
【作 者】王陈汉;孙文博;刘宇驰;阎华;钱春发;肖红;刘宏毅
【作者单位】南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属脑科医院研究所;南京医科大学附属脑科医院神经外科
【正文语种】中 文
环境与资源保护委员会
【中图分类】R739.41
胶质瘤是颅内最高发的实体肿瘤[1-2]，由于恶性胶质瘤的临床方法较为局限，且手术后有着很高的复发率，中位生存期仅为14.6个月[3]。目前通过研究胶质瘤的临床表现、影像学表现，以及细胞生物学的特性，对胶质瘤的已经取得了很大的进步；并且培育了U251、U87、U373[4]等广泛用于科学研究的细胞系。这些细胞用于探讨肿瘤细胞的起源、干细胞的提取、药敏以及放疗敏感等各个方面，取得了大量的研究成果[5-6]。
虽然利用已经培育完成的细胞系进行传代培养较为方便，可是由于经历多次传代，细胞系的遗传性质以及细胞生物学特性难免会发生改变，并且无法体现临床胶质瘤患者的个体特性。为了给临床个体化提供帮助，培养人脑胶质瘤原代细胞就显得尤为重要。胶质瘤原代细胞是指利用肿瘤组织在体外进行胶质瘤细胞的培养，目前常用的培养方法有组织块培养法、单细胞悬液法等方法。人脑胶质瘤细胞是研究胶质瘤的重要载体，原代培养方法以及传代培养方法均可获得实验所需的人脑胶质瘤细胞，相对于已有细胞系的传代培养，原代培养虽然技术较为复杂，且成功率相对较低，但是原代细胞在最初传代的几代之内，由于其刚刚离体的特点，能更好地代表来源组织及个体的生物学特性[7]。以原代细胞进行实验，所取得的结果有着更强的借鉴意义，对临床工作诸如诊断以及的意义也更为重大[8]。本研究采用组织块培养法，对胶质瘤原代细胞的培养过程进行优化，旨在为将来个
体化研究临床胶质瘤细胞的生物学特性奠定基础。
1.1 材 料
1.1.1 肿瘤组织 人脑胶质瘤瘤体组织来自南京医科大学附属脑科医院神经外科，WHO病理分级为Ⅳ级(胶质母细胞瘤)，大小约为1 cm×1 cm×1.5 cm。本研究通过医院伦理审查委员会批准(批件号：2016-KY049)。
1.1.2 主要实验仪器 40 CFL型荧光倒置显微镜(Carl Ziess Axiovert)；HHS型温控水浴箱(上海博训)；DGG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信)；CO2培养箱(美国Revco)；28RS型4℃离心机(Biofuge)。
1.1.3 主要试剂及配制 (1)主要试剂：BD基质胶(Invitrogen),DMEM培养基[双抗Gibco(Carlsbad,CA)]，胎牛血清Gibco(Carlsbad,CA)，胰蛋白酶(Sigma)；(2)主要试剂配制：D-Hanks液配制：NaCl 8.0 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4·12H2O 0.13 g，KH2PO4 0.06 g，NaHCO3 0.35 g，加水定容至1 L，高温高压灭菌，4℃保存备用。胰蛋白酶配制方法：以D-Hanks液溶解，0.22 μm微孔过滤器过滤除菌，4℃保存备用，使用浓度为0.25%。
1.2 人脑胶质瘤组织的种植及培养 采用组织块原代培养法培养胶质瘤原代细胞。
1.2.1 种植 (1)取自手术切除的胶质瘤瘤体标本，放置于含有5 ml D-Hanks液的培养皿中，用无菌刀片以及无菌镊子仔细去除瘤体表面的血丝及杂质，并用D-Hanks液冲洗2～3遍，使瘤体表面相对光整；(2)用无菌刀片以及镊子仔细将肿瘤组织切割成2～3 mm3 大小的组织块，切割过程中尽量不要产生过多碎片；(3)用无菌铁丝滤网去分离组织小块，并将其置入含有3～4 ml胰蛋白酶溶液的培养皿中，用镊子小心分离，消化10～15 min，待胰蛋白酶溶液稍浑浊，即可用铁丝滤网取出组织块，重新置入含有D-Hanks液的培养皿中；(4)视实验需要，取出若干大小适中的培养皿，用镊子将D-Hanks中的组织块以5 mm的间距均匀地种植在培养皿中，并加入刚好润湿培养皿底部的15%胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2无菌培养箱中。
1.2.2 换液培养 种植后的培养皿于6 h后取出，用移液换液，第2次加入的培养液应能恰好浸润全部组织块(不可加入过多，使其底部脱离培养皿)。而后每天观察2～3次，拍照记录其生长情况，并每隔24～36 h用移液更换培养液。5～7 d后，会有少量细胞从若干组织块周围爬出；大约15～20 d后，大量细胞爬出。尼伯特台风路径图
1.2.3 提取 等细胞爬满至70%～80%汇合率后，用镊子或者移液移除组织块，换液过夜。而后用胰蛋白酶消化培养皿中的贴壁细胞，传代至玻璃培养瓶中，培养液采用10%FBS的DMEM培养液，扩增至所需数量，并在2～3代内进行相关实验。
1.3 细胞迁移能力检测 (1)先用防水标记笔在6孔板背后，用直尺比着均匀地划横线，约每隔0.5～1 cm划一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；(2)胶质瘤原代细胞经传代培养，收集对数期细胞接种到6孔板中，每孔约5×105个细胞；(3)过夜后，细胞的汇合度大约为80%～90%，用灭菌的10 μl移液头从细胞层中划过，使细胞层出现1～2 mm宽的无细胞的区域；(4)用D-Hanks液洗细胞3次，洗去悬浮的细胞，加入无血清DMEM培养液；(5)在倒置显微镜下观察拍照，此时记为第0 h，之后在24 h时再观察拍照；(6) 将0 h测量的划痕宽度记为W0，24 h测量的划痕宽度记为W24，根据公式：迁移率= (W0-W24)/W0×100%，计算出24 h的迁移率。
1.4 细胞侵袭能力检测 (1)基质胶准备：将-80℃的Matrigel 4℃过夜，使其变成液态；(2)将Matrigel和无血清的DMEM培养液按1∶8稀释，加入Trans-well的上室中，每孔50 μl，37℃预置2 h使其聚合成凝胶；(3)胶质瘤原代细胞经传代培养，收集细胞，无血清培养基清洗3
次，计数，配成细胞悬液，细胞密度为1×105个/ml；(4)用无血清DMEM培养液清洗Matrigel 1次，Trans-well上室加细胞悬液100 μl；(5)Trans-well下室中加入500 μl含有15%胎牛血清的DMEM培养液；(6)37℃，5%CO2培养箱中培养20 h；(7)取出Trans-well上室，用PBS清洗2遍，以湿棉签擦去聚碳酸酯膜上未穿过膜的细胞；(8)无水乙醇固定15 min，风干，用0.1%结晶紫染15 min;(9)在倒置显微镜下观察、计数，每孔随机取5个视野(×200)拍照，取平均值。
2.1 细胞的形态 组织块培养法获取的人脑胶质瘤原代细胞,培养过程中，胶质瘤细胞的形态不尽一致，刚游离出的原代胶质瘤细胞呈圆形，贴壁后仍然有着很强的折光性。而后在组织培养过程中，细胞的形态呈现多角、梭形、圆形等不同形态(图1)。
2.2 细胞的生长情况 传代后的胶质瘤细胞在最初2～5代内形状稳定，传代频繁，极少悬浮、脱落。5代之后，若沿用之前的培养方案，原代细胞会渐渐失去活力，形态各尽不同，悬浮细胞增多，增殖减缓。
2.3 细胞的迁移能力 见图2。在细胞划痕实验中，通过观察0 h、6 h、12 h、24 h时的图像，计算24 h时的细胞迁移率，所得的平均迁移率为38%，s2=0.23。
2.4 细胞的侵袭能力 见图3。通过Trans-well小室实验观察胶质瘤原代细胞的侵袭能力，计数5个视野的平均侵袭细胞数为40个，s2=0.15。
冷弯管
胶质瘤细胞的原代培养是指利用人脑胶质瘤的组织块进行胶质瘤细胞的体外提取，培养。由于原代细胞刚离体不久，因此，相对于其他细胞系，能更好地反映体内的细胞生物学特性[9]，目前国内外有许多相似的研究，并取得了不小的进展[10]。目前主流的培养原代胶质瘤细胞的方法有组织块原代培养法、单细胞悬液培养法、单克隆培养法、悬浮培养法等。
组织块原代培养法虽然耗时较长、成功率低，但具有操作简便、需要组织量较少等特点[11]。而单细胞悬液培养法所需的组织量较大，且培养过程中容易污染，但是如果操作得当，培养成功率相对较高；单克隆培养法和悬浮培养法为辅助培养方法，常常添加不同的诱导因子用于获取干细胞[12]等特殊细胞，培养方法较为复杂，成功率也较低。
综合各种方法的特点及本实验室的条件，本研究选用了组织块原代细胞培养法，操作过程中应注意无菌操作，培养环境应相对稳定，观察时间不可过长，并每天观察细胞的状态，根据组织块以及细胞的状态进行换液；同时换液时可根据生长情况进行全量或者半量换液，
保留相对充裕的生长因子。同时培养液可根据情况添加青霉素和链霉素，防止细胞污染。原代细胞相对于细胞系相对脆弱，在培养后期，原代细胞形态改变，增殖减慢，因此，应在早期进行相关实验。
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