^w iy tB s s-iy^m PTCA(PART B: CHEM. ANAL.)4M 知识与经验D01：10.11973/lh jy-h\202104014
维生素B6及其有关物质
陈健、陈突飞、王莉1，盛力1，沈大冬\韩忠耀
(1.浙江医药股份有限公司研究院.绍兴312500; 2.黔南民族医学高等专科学校，都匀558000)
中图分类号：0657.7 文献标志码： B 文章编号：1001-4020(2021)04-0362-04
磷酸吡哆醛（PLP)是维生素B6(VB S)的主要辅酶活性形式，参与多种氨基酸代谢转化[1_2]，其结构式见图1。其中，涉及氨基酸多种反应，在代谢转换、物质合成中发挥着极为重要的作用[3]。P L P既 可以作为药物用于临床，促进转氨作用提高体内多巴胺的含量[4]，进而用于帕金森综合征[5]；也可 以作为其他原料药的起始物料，用于合成羰基酰胺类药物等研究[6]。
〇
图1P L P的结构式
Fig. 1S tructural form ula of PLP
P L P—般以VB6为原料合成，因此，在PIJP 质量研究中，VB6(已知杂质）和其有关物质（未知杂 质）的含量测定具有十分重要的意义。长久以来，起 始物料的质量控制在原料药注册技术要求中一直有着举足轻重的地位，人用药品注册技术要求国际协调会议（IC H)及各国药审监督机构相继出台相关技术要求予以规范。目前，对于P L P的研究，主要以 合成工艺改进、生物代谢转化[9〜]及临床[n 12]居多，对于其质量控制的相关研究鲜有报道。
本工作应用高效液相谱法（HPLC)建立了P L P中VB6及其有关物质含量测定的方法，为PLP 质量标准的建立，提供更为科学的试验依据和方法参考。 收稿日期：2020-04-26
* 通信联系人。317230913@qq 1试验部分
l.i仪器与试剂
Agilent 1260型高效液相谱仪，配紫外检测器（VWD)、二极管阵列检测器（DAD)和Agilent OpenLab CDS2.3谱工作站；XS205型分析天平；S220 型 pH 计。
磷酸二氢钾-1-庚烷磺酸钠缓冲溶液：称取0.85 g磷酸二氢钾和3.0 g卜庚烷磺酸钠.溶于1L 水中，并用三氟乙酸调节溶液p H至3.0。 稀释剂：称取磷酸氢二钾4.33 g溶于1L水中，作为试验中配制溶液的稀释剂备用。
P L P对照品储备溶液：2.50 g •L1，称取PLP 对照品50.0 m g于20 m L容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
VB6对照品储备溶液：62. 5 mg•L\称取VBS对照品12.50 m g于200 m L容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
P L P对照品溶液：5.00 mg •L-1，称取P L P对 照品12.50 m g于25 m L容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。移取该溶液1m L，置于100 m L容 量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
VBS对照品溶液：2.52 mg .L^1，称取VB S对 照品6.30 m g于25 m L容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。移取该溶液1m L，置于100 m L容量 瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇勻。
P L P供试品溶液：0.5 g •L、称取P L P供试品约25 m g于50 m L容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。
P L P对照品（批号：100855-200701，纯度为99.3%)，VBS对照品（批号：100116-201705，纯度为
实验语音学•362 •
A /n m
(a )
PLP
100.0%) ;P L P 供试品（来自3家公司，批号分别为 170803H 、20191015、AR 1930N 01)；磷酸二氢钾（纯 度为99%)，磷酸氢二钾（A C S 级），1-庚烷磺酸钠 (纯度为99.5%)，三氟乙酸（纯度为99.9%)，乙腈 (纯度不小于99.9%)；试验用水为超纯水。1.2仪器工作条件
Diamonsil Plus Ci 8谱柱（250 m m X 4.6 m m ,
5 ;im )；检测波长 294 n m ；流量 0.9 mL • min — 1 ；柱 温47 °C ；进样量5 fiL ；流动相：A 为磷酸二氢钾-1- 庚烷磺酸钠缓冲溶液.B 为乙腈。梯度洗脱：初始A 为 100%，保持 13 m in ;13 〜25 min 时，A 由 100% 降至80%，保持10 min 。1.3 试验方法
移取一定量的待测液（对照品溶液或供试品溶 液），按谱条件进样测定，记录目标物峰面积。采 用外标法定量，以峰面积计算VB 6含量，其他未知 杂质使用主成分对照法计算。2华南城刘晓东
结果与讨论
2.1 谱行为
分别移取P L P 对照品储备溶液2 m L 和VB 6 对照品储备溶液0.4 m L ，置于同一个10 m L 容量瓶 中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。于谱条件下进样 测定，所得谱图见图2。
PLP
VB,
_____,______. . .
.~jl L a ____
5
10
15
20
25
30
35
保留时间/m in
图2 P L P 和VB 6对照品混合溶液谱图
Fig. 2 Chrom atogram of the m ixture solution of PLP
and VBfi reference
为方法建立的关键。在方法建立初期，本研究根据
p l p 的化合物结构以及合成工艺中潜在杂质分析,
首先考察了流动相分别为烷基磺酸盐和四烷基铵盐 离子对试剂时对各组分分离的影响。结果显示:
VBS 在四烷基铵盐为流动相的谱体系下，难以保
留。因此，试验选用烷基磺酸盐中含碳链较长的庚 烧磺酸钠盐（1-庚烷磺酸钠）作为流动相A 相，同时 用三氟乙酸和磷酸二氢钾将p H 调节至酸性，使
P L P 和VBfi 中的氮原子均带正电荷，与离子对试剂
紧密结合，再通过柱温以及流量的优化调整，使
P L P 中的VBS 以及其他杂质，均有良好的保留时间
和较好的分离度，优化后的谱条件见1.2节。2.2.2 检测波长
H J P 和其他杂质最大吸收波长为294 n m ，VB 6升学指导测验
最大吸收波长为292 nm ，通常紫外波长检测允许误 差范围为±2 n m •因此，结合PL P 、VB 6和其他杂质 的紫外吸收情况（图3)及流动相噪声背景等，试验 选择检测波长为294 run ，经方法验证，在该波长下 检测方法具有良好的稳健性。
由图2可见：P L P 和VBS 可以完全分离.相互 之间无干扰，方法具有良好的专属性。2.2谱条件的优化2.2.1 流动相、流量和柱温
根据查阅文献可知，可使用H P L C 测定VB S 的 含量|3 |5]。由于P L P 是一种非常重要的维生素B 族化合物:16]，且为极性较强的两性化合物，因此使 其和有关物质均在谱体系下得以合适的保留.成
A /n m
(b ) VB6
教育财会研究图3
P L P 和VB 6紫外吸收全波长光谱图
Fig. 3 U V absorption full wavelength spectrogram s
of PLP and VB6
2.3标准曲线和检出限
配制P L P 和VB 6对照品溶液系列，按谱条 件进样测定。以P L P 和VB 6的峰面积为纵坐标，
-圯莩分冊
陈健.等：高效液相谱法测定磷酸吡哆醛中维生素b 6及其有关物质
2
1
1
• 363
•
两者的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，所得线性（3S/N)；以10倍信噪比计算P L P和VB S测定下限回归方程和相关系数见表1。（10S/N)，结果见表1。
以3倍信噪比（S/N)计算P L P和VB6检出限
_____________________________________陈健.等：高效液相谱法测定磷酸吡哆醛中维生素氏及其有关物质
表1P L P和v b4的线性参数、检出限和测定下限
Tab. 1Linearity parameters, detection limits, and lower limits of determination of PLP and VB6
目标物线性范围!〇/
(m g • L-1)
线性回归方程相关系数
检出限/?/
(m g • L-1)
测定下限"
(m g • L-1)
PLP0.50 〜3.7y = A A67x + 9.896X 10-20.999 70.250.50 VB60.50 〜3.83； = 1.323X 10 x-1.904X10-' 1.0000.250.50
2.4方法的精密度
称取P L P供试品25 m g于50 m L容量瓶中，向其中加人VB6对照品储备溶液2 m L，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，平行配制6份，按谱条件进样测定。结果显示：6份供试品溶液中VB S的平均质量分数为0.48%，相对标准偏差（RSD)为0.92%；其 他未知杂质和总杂质平均质量分数分别为0.39%, 1.71 %，RSD分别为 2.8%,1.5%。
另一分析员，在不同日期使用不同仪器，重复平行配制上述溶液6份，按谱条件进行测定。结果 显示：6份溶液中VBS的平均质量分数为0.54%，R S D为0.89%；其他未知杂质和总杂质平均质量分数分别为 0.47%,1.82%，RSD分别为 2.5%，1.3%。表明在该谱体系下，测定P L P中的VB6含量及其有关物质具有较好的重复性。
2.5 回收试验
称取9份P L P供试品25 m g于50 m L容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为空白VB6供试品溶液。按照ICH Q2B[17]中范围的要求，每3份空 白供试品溶液作为一组，3组供试品分别在高、中、低
3个水平的加标量下加人VBS对照品，按谱工作条件进样测定，每份重复测定5次，计算VB S的 回收率和测定值的RSD，结果见表2。
由表2可知：VBS的回收率为99.5%〜102%，该方法可准确定量P L P中VBS的含量。
2.6 方法的稳健性
固定其他谱条件，分别改变谱条件中的流量和柱温两个条件，以考察方法的稳健性。称取P L P供试品25 m g于50 m L容量瓶中，向其中加入VB6对照品储备溶液2 m L，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，平行配制6份，考察流量为0.8 mL •min_1和 L0 mL .min—1 ，柱温为46 °C和48 °C时，供试品中各组分质量分数的变化情况，结果见表3。
表2回收试验结果（n=5)
Tab. 2 Results of test of recovery (n = 5)
端子箱样号
加标量m/
mg
回收量m/
mg
回收率/
%
平均回收率/
%
RSD/
%
10.024 70.025 ********.83
20.025 1102
30.024 8100
40.123 60.123 199.699.80.35
50.123 199.6
60.123 8100
70.185 40.184 599.599.80.31线性规划法
80.185 299.9
90.185 5100
表3方法的稳健性试验结果
Tab. 3 Results of test for robustness of the method
谱条件
VB6x v/
%
其他未知
杂质te;/
%
总杂质u»/
%流量/
(m L • min —1 )
柱温/
r
0.9470.540.39 1.71
0.8470.540.44 1.70
1.0470.550.43 1.74
0.9460.550.45 1.75
0.9480.540.43 1.72
由表3可知：流量和柱温的小幅度变化，VB6、其他杂质和总杂质的检测结果基本一致。表明该方法具有良好的稳健性。
2.7样品分析
取来自3个生产厂家的不同批号的P L P供试 品溶液、VB6对照品溶液和P L P对照品溶液，按试验方法测定其中VB6及其他有关物质的质量分数，结果见表4; VB6对照品溶液和其中批号为170803H的供试品溶液谱图见图4。
•364 •
表4样品分析结果
Tab. 4 Analytical results of samples
%
批号
VB6其他未知杂质
总杂质
170803H -0.380.8620191015—0.62 1.53AR1930N01
-
0.190.46
VB6
0 5 10 15 20 25 30 35
t / min
(a)
VB 6对照品溶液
PLP
0 5 10
15 20
25 30 35
"m in
(b )
P L P 供试品溶液（批号：170803H)
图4
VB6对照品溶液和P L P 供试品溶液谱图 Fig. 4
C hrom atogram s of VB r reference solution
and P L P sam ple solution
本工作建立的高效液相谱检测方法，可以更 准确地测定P L P 中VB 6和其他未知杂质的含量， 且方法的灵敏度高、重复性好、专属性强，可为PLP 的质量标准建立提供参考。参考文献：
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