薛令军;李培梅;孙瑜宁;张恩东;刘艳;孙彩波;刘新义;孙文海
【摘 要】目的 检测β-连环素和P65在喉鳞状细胞癌组织中的表达,探讨其与喉癌不同病理分级、临床分期以及二者在喉癌中表达的相关性.方法 应用免疫组化技术检测42例喉癌及20例癌旁炎性组织石蜡切片中β-连环素和P65的表达,并分析上述指标与喉癌病理分级和临床分期的关系.结果 ①β-连环素在喉癌组织中的异位表达率66.7%(28/42),p65在喉癌组织中的阳性表达率为71.4%(30/42),二者在喉癌中的表达与癌旁炎性组织相比差异有统计学意义(P <0.01)0)β-连环素异位表达在喉癌不同病理分级、临床分期、有无淋巴转移、生存时间是否超过5年有差异性,随着病理分级、临床分期增高而表达率增高(P < 0.05)a P65表达与临床分期、淋巴转移相关,但与病理分级及5年生存率无统计学意义(P>0.05)a03 R-连环素、P65在喉癌同时表达22例,有明显相关性(r=0.392,P <0.05).结论 β-连环素、P65异常表达与喉癌分化、分期、转移可能有关. 【期刊名称】《中国耳鼻咽喉颅底外科杂志》
【年(卷),期】2011(017)001
城市肌理【总页数】7页(P11-17)
【关键词】喉肿瘤;癌,鳞状细胞;癌基因蛋白质类
【作 者】薛令军;李培梅;孙瑜宁;张恩东;刘艳;孙彩波;刘新义;孙文海
【作者单位】青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院,内分泌科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属威海医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,威海,264200;青岛大学附属医院耳鼻咽喉-头颈外科,山东,青岛,266023
【正文语种】中 文
【中图分类】R739.6民航资源中国网
喉癌约占全身恶性肿瘤的1% ～5%［1］，其病理形成模式和分子机制尚未完全阐明。P6
5是构成细胞核因子 κB(NF-κB)的主要形式，控制细胞因子、黏附分子及生长因子等基因的表达，在许多恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用［2］。β-连环素(β-catenin)是一种细胞骨架蛋白，既与细胞间黏附作用有关，又是Wnt信号传导途径中的重要成分，这两种作用都与肿瘤的发生和发展密切相关。本研究拟通过免疫组化方法检测喉鳞癌及超出喉癌边界0.5cm以上癌旁组织中 P65和 β-连环素的表达，分析二者表达与喉癌临床特征的相关性及临床意义。
1 材料与方法
广场雕塑
1.1 材料
收集青岛大学医学院附属医院病理科2001年1月～2002年1月头颈外科住院手术的原发喉鳞状细胞癌石蜡标本42例，相应癌旁炎性组织20例作为对照(距肿瘤边缘≥0.5cm)。所有肿瘤组织术后病理均证实为鳞状细胞癌，所有癌旁非癌组织术后病理均证实为慢性炎症。其中男35例，女7例;年龄40～75岁，平均60.5岁。喉癌患者中有淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者22例(淋巴结转移根据术后病理而定)，声门上型为14例，声门型为26例，声门下型为2例。临床分期采用2002年UICC TNM分类分期标准，临床Ⅰ、Ⅱ期18例，临床Ⅲ、
Ⅳ期24例。
中文核心期刊要目总览20131.2 试剂
兔抗人 phospho-NF-Kb、P65(ser276)多克隆抗体、鼠抗人 β-连环素单克隆抗体EnvisionTM+加强型试剂盒、抗原修复液、APES黏片剂，以上试剂均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.3 免疫组织化学(SP法)
采用免疫组织化学染，石蜡组织切片经二甲苯、乙醇脱蜡，用 PBS冲洗。切片浸在已沸腾的枸橼酸盐缓冲液(0.01mol/L pH6.0)中于微波炉持续15min行抗原修复，自然冷却至室温后取出。用PBS冲洗，加3%过氧化氢在室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。用PBS冲洗，加正常非免疫动物血清在室温下孵育10min。除去血清，加 P65或 β-连环素单抗于湿盒中在37℃温箱中孵育2h再在4℃冰箱过夜。用PBS冲洗，加生物素标记的二抗在室温下孵育10min。用PBS冲洗，加链霉素抗生物素过氧化物酶溶液在室温下孵育10min。用PBS冲洗，加新鲜配置的DAB溶液，显微镜下看见阳性部位着后即用自来水
终止反应。再用苏木精复染，自来水冲洗返蓝。经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。37℃温箱烘烤1h。最后放于4℃冰箱保存。以试剂公司提供的阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判断
细胞计数:首先在低倍镜下到代表性染区域，然后在高倍镜(×400)下5个视野，用目镜下放置的测微器记录网格内的所有肿瘤细胞数及所有阳性染的肿瘤细胞数。每例计数1，000个细胞。所有切片计数均由2人分别进行，然后取平均值。
1.4.1 P65阳性表达水平 p65蛋白以细胞质或细胞质和核膜同时着棕黄或黄褐为阳性反应，采用染强度评分乘以阳性细胞面积评分［3］。染强度评分为，0级:阴性染，与背景一致;1级:弱阳性染，淡黄;2级:阳性染，黄;3级:强阳性染，棕黄。阳性细胞面积分为0级:阳性细胞＜10%;1级:阳性细胞≥10% ～25%;2级:阳性细胞≥26%～50%;3级:阳性细胞≥51% ～75%;4级:阳性细胞占≥76% ～100%。两者相乘得到的定性积分表达≤3为阴性表达，≥4～6为弱阳性(+)，≥7～9为阳性(++)，≥10～12为强阳性(+++)。
决战朝鲜攻略1.4.2 β-连环素染结果判定［4］ β-连环素在正常上皮细胞中仅表达于细胞膜。组织染强度评分同上。两者相加得到的定性记分以上的呈2级以上黄细小颗粒状定为阳性;2级以下定为阴性。以癌旁非癌黏膜免疫染模式(主要为细胞膜染)为对照，光镜下任意选取5个高倍视野，按阳性细胞所占比例的平均数分级，膜表达阳性细胞率＞75%为膜表达正常，膜表达阳性细胞率≤75%为膜表达降低，癌细胞胞质和(或)胞核出现≥10%，2级阳性表达为 β-连环素异位表达。β-连环素膜表达降低和胞质、胞核异位表达均归为 β-连环素异常表达。
1.5 统计学处理
图1 β-连环素在癌旁组织中的膜表达(SP法，×400)
图 3 β-连环素在喉癌中膜表达降低(SP法，×400)
采用 SPSS10.0for Windows软件进行统计分析，组间和组内率的比较采用卡方检验，P65和 β-连环素之间的相关性分析采用 Spearman相关分析。P＜0.05具有统计学意义。
民主法制
2 结果
2.1 β-连环素、P65在喉癌中的表达
β-连环素在喉癌旁组织黏膜中表现为膜表达［5］(图 1)，呈黄或棕黄细颗粒状，有的在细胞浆内可见淡染。42例喉癌组织中，14例膜表达阳性(图2);28例有膜表达降低或胞浆表达，其中膜表达降低5例，膜表达降低合并异位表达23例(图 3)，异常表达率为 66.7%(表 1)。p 65蛋白在喉癌组织中阴性表达12例(图4)，阳性表达 30例(图 5)，阳性率为71.4%。在20例喉癌旁黏膜组织中3例有p65的表达，两组阳性表达差异有统计学意义(表 2，P＜0.05)。
图2 β-连环素在喉癌组织中阳性表达(SP法，×400)
图4 P 65在喉癌组织中阴性表达(SP法，×400)
图5 P65在喉癌组织中阳性表达表现为细胞质或细胞核膜呈棕黄染(SP法，×400)
表1 β-连环素在喉癌及癌旁炎性组织中的表达(例数，%)β-连环素表达组织类型 n P异常 正常癌旁炎性组织 20 0(0.0)20(100.0)＜0.05喉癌组织 42 28(66.7)14(33.3)
表2 P65在喉癌及癌旁炎性组织中的表达(例数，%)P65组织类型 n 表达P阳性 阴性癌旁炎性组织 20 3(15.0)17(85.0)＜0.05喉癌组织 42 30(71.4)12(28.6)
2.2 β-连环素、p65的表达与喉癌临床特征的关系(表3)
在42例喉癌组织中，β-连环素在喉癌Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期的异常表达率分别为50%，88.9%，Ⅲ、Ⅳ期明显高于Ⅰ、Ⅱ期;在不同病理分级、有无淋巴转移、生存时间是否超过5年的异常表达率均有统计学意义。但与患者年龄无关。
P65在喉癌Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期的表达阳性率 58.3%，88.9%，Ⅲ、Ⅳ期明显高于Ⅰ、Ⅱ期，P65表达与临床分期、淋巴转移相关(P＜0.05)，但与年龄、病理分化、5年生存率无关(P＞0.05)。
表3 β-连环素、P65的表达与喉癌临床分期及特征的关系临床特征 n β-连环素表达异常 (%)表达阳性 (%)P65年龄＞50岁组 29 19 65.5% P＞0.05 21 72.4% P＞0.05＜50岁组 13 9 69.2% 9 69.2%临床分期Ⅰ、Ⅱ期 24 12 50% P＜0.01 14 58.3% P＜0.01Ⅲ、Ⅳ期 18 16 88.9% 16 88.9%淋巴转移无22 12 54.5% P＜0.05 12 54.5% P＜0.05有20 17 85.0
% 18 90.0%病理分级(鳞癌)I级 20 9 45% P＜0.05 15 75% P＞0.05II级 13 10 76.9% 9 69.2%III级 9 8 88.9% 6 66.7%生存时间＞5年 30 17 56.7% P＜0.01 23 76.7% P＞0.05＜5年12 11 91.7% 7 58.3%
2.3 β-连环素、P65二者共表达与喉癌的关系
在42例喉癌组织中，β-连环素和 P65在喉癌同时表达者22例，有明显相关性(r=0.392，P＜0.05)，但未发现二者同时表达在不同病理分级及临床分期的差异。
表4 β-连环素、P65在喉癌中关系p65表达β-连环素表达合计异常 正常阳性22 30阴性 6 6 12合计814 28
3 讨论
β-连环素是 Wnt通路的关键信使，胞浆或核内β-连环素聚集异常是 Wnt通路致癌的关键因素［6］。β-连环素以结合型和游离型两种形式存在于胞浆中。结合型在成熟细胞内与钙黏蛋白(E-cadherin E-cad)结合，形成 E-cad/cat复合体，影响细胞的运动和黏附;游离型则可以与细胞内结肠腺性息肉病蛋白(adenomatous polyposis colic APC)结合，参与Wnt信号传
导途径，调节细胞的增殖可以导致细胞癌变，两种类型蛋白之间保持着动态平衡［7］。当 β-连环素功能变化时就会失去与 E-cad的“锚定”连接，细胞失去黏附功能，导致细胞分散乃至侵袭行为出现，因此膜 β-连环素功能异常也是导致细胞向癌变方向发展的原因之一［8］。当Wnt信号通路激活时，胞浆中 β-连环素浓度升高，与转录因子T淋巴细胞因子/淋巴样增强因子-1(TCF/LEF-1)结合进入细胞核内，启动靶基因 c-myc、CD44等的复制与转录，导致细胞异常增殖并癌变。本实验42例喉癌组织28例显示 β-连环素表达异常，14例正常表达，而癌旁炎性黏膜组织均正常表达，说明 β-连环素表达异常与喉癌的发生关系密切，可能是喉癌发生过程的一个重要事件。目前多项研究发现在大肠癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌等多种肿瘤中存在胞浆或核内 β-连环素异常聚集［9-12］。本研究还显示喉癌β-连环素膜表达减少与异位表达同时存在，其中的内在联系有待于进一步研究。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议