从葡萄籽中提取的寡聚原花青素在激活的肝星状细胞中抑制NFkB信号传导: 参与JNK /ERK MAPK和PI3K / Akt通路 在本研究中，我们旨在揭示葡萄籽中低聚原花青素（OPC）对脂多糖（LPS）活化，HSC-T6，大鼠肝星状细胞系的潜在抗纤维化作用.。HSC-T6细胞在加入LPS前用OPC处理1小时，然后在指定时间内孵育。OPC抑制HSC-T6细胞的细胞活力，并减少在lps诱导的HSC-T6细胞中胶原蛋白I，α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA），金属蛋白酶I（TIMP-1）组织抑制剂在LPS诱导的蛋白表达。OPC还显着抑制LPS刺激的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（Akt），细胞外信号调节激酶（ERK）和c-Jun N-末端激酶（JNK）的磷酸化。 此外，OPC预处理阻止LPS-引发的核因子κB（NF-kB）从细胞质转移到核。 OPC，以及NF-kB，PI3K和JNK的特异性抑制剂可以有效抑制α-SMA和胶原蛋白I的表达。 总之，我们证实了OPC的抗纤维化机制可能通过JNK / ERK MAPK和PI3K / Akt磷酸化抑制NF-kB的活化来参与HSC活化和转分化的抑制。 因此，OPC通过涉及MAPK-PI3K / AKT途径的NF-kB调节具有HSC活化的潜在抑制性质。 1.介绍
气辅成型
肝纤维化是慢性肝炎的常见病理结果，最终会导致肝硬化甚至肝癌。肝纤维化进展的特点是细胞外基质过多(ECM)沉积，包括胶原蛋白I和平滑肌肌动蛋白(a - sma) [1]。活化的肝星状细胞(HSC)在肝纤维化中起着关键作用，所以控制肝星状细的活化是抗纤维化的理想靶点。[2]通过不同的刺激，静止的肝星状细胞被激活和分化，然后由肝星状细胞产生的大量的细胞外基质(ECM)沉积于纤维组织[3,4]。在HSC激活过程中，ECM定量地和定性地增加。这些过度的ECM导致了ECM降解与生成的不平衡。因此，抑制HSC的增殖和活化是一种理想肝纤维化的方法。
脂多糖(LPS)，革兰氏阴性细菌的主要细胞壁成分，是toll样受体4(TLR4)的主要配体，在许多类型的肝细胞中表达，包括Kupffer细胞，肝细胞和HSCs。特别是,TLR4在HSC中的表达在肝纤维化中起关键作用[5]。肝损伤后,肠粘膜渗透性增加，导致内毒素易位增加[6]。虽然库普弗细胞是LPS的最佳表征靶点，但HSC也对低浓度的肠源性内毒素具有高度的反应[7]。在人肝标本分离的活化HSC中也观察到LPS诱导的核因子-κB（NF-kB）活化[8]。
NF-kB在HSC活化和纤维发生的进程中起关键作用[9]nf - kb是二聚体转录因子家族，在肝纤维化的发展过程中起着核心作用[10]。nf - kb激活发生在活化的HSCs中，nf - kb抑制剂
可以有效阻断小鼠肝纤维化[11]。因此，阻断nf - kb信号通路可以抑制HSC激活，进而减弱肝纤维化。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/ Akt通路可增强NF-kB的转录活性[12] 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K /蛋白激酶B（AKT）之间的串扰可能会调节细胞存活[13] JNK，PI3K和Akt的激活诱导具有促纤维化作用的HSC的激活[14,15]。已经使用药理学或遗传学方法建立了对HSC中PI3K / Akt信号传导的抑制，从而抑制HSC的激活[16]。因此，通过MAPK和PI3K / Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。因此，通过MAPK和PI3K / Akt途径靶向NF-kB的新药物和方法可能有益于阻断肝纤维化进展。低分子原花青素复合物（OPC，也称为原花青素），一类类黄酮化合物，通常从葡萄籽以及各种水果和蔬菜中获得，具有有效和广泛的药理和活性[17]。OPC是一种高分子量的聚合物，包括原花青素，原花翠素类和花葵素[ 18 ]。OPC是功能强大的抗氧化剂，可以摆脱自由基。丰富的体内科学证据表明，OPC防护小鼠酒精 - 四氯化碳 - ，二甲基亚硝胺 - 或硫代乙酰胺 - 诱导的肝纤维化[19-22]。来自蓝莓V.virgatum的叶片的原花青素阻断了血小板衍生生长因子（PDGF）诱导的人类HSC活化[23]，表明OPC可能是肝纤维化的潜在剂。然而，OPC在抑制通过MAPK和PI3K / Akt信号传导的HSC活化的确切机制迄今尚未得到充分阐明。在目前的研究中，我们利用LPS激活的HSC体外模型来研究OPC的潜在
抗纤维化作用。我们的数据表明OPC通过在纤维化过程中抑制NF-kB活化来抑制HSC转分化，并且这些事件可能由ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt途径介导。
2.材料和方法
2.1材料
来自于伊方科技有限公司（中国天津）的葡萄籽中的OPC（纯度> 99.80％）。LPS和二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma Chemicals Co.（St Louis，MO，美国）。OPC溶解于DMSO中，细胞DMSO浓度小于0.5％，不影响细胞生长[24]。抗PI3K，抗磷酸化PI3K，抗Akt和抗磷酸化Akt抗体购自Cell Signaling Technology（Beverly，MA，USA）。抗NF-kB p65和抗Topo I抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc.（Dallas，Texas，USA）。 抗肌动蛋白和抗-α-SMA抗体购自Abcam（Cambridge，MA，USA）。 JSH23（NF-kB抑制剂），Ly294002（PI3K抑制剂）和SP600125（JNK抑制剂）购自Sigma-Aldrich。 BCA蛋白测定试剂盒购自Beyotime Inst。生物技术。 （中国江苏）。 所有细胞培养物均购自Fischer Scientific。
2.2 细胞培养
将HSC-T6细胞在含有5％CO 2 -95％空气的湿润培养箱中，在含有10％胎牛血清（FBS），100单位/ ml青霉素G钠和100mg / ml链霉素的DMEM中培养。 HSC-T6是永生化的大鼠肝星状细胞系，具有原代HSC的特异性表型和功能。
2.3通过MTT法测定细胞活力
美洲虎xk8使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基咔唑溴化物（MTT）测定法测量细胞活力。 将HSC-T6细胞以1×10 4个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在存在或不存在OPC的条件下处理24小时。 加入MTT，然后再培养3小时。 抽出含有MTT的培养基，用DMSO代替。 使用酶标仪在540 nm检测MTT对紫番茄的减少。浙江湖州织里镇
2.4。 蛋白质印迹分析
从HSC-T6细胞中提取总蛋白，用Western和IP的裂解缓冲液提取，用核和细胞质蛋白提取试剂盒（中国江苏省生物技术研究所）制备核和胞质提取物。 通过8-12％的十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜。 并用含有5％脱脂乳和0.05％吐温20的PBS封闭膜，然后与特异性一级抗体一起温育，随后与H
RP-缀合的二抗孵育。 最后，用增强型化学发光（ECL）检测系统（Beyotime，Nanjing，Jiangsu，China）显现目标蛋白，并暴露于X射线胶片。 用Bio-Rad Quantity One软件分析每个条带的密度。 b-肌动蛋白用作加载对照。
2.5。 免疫细胞化学染
2012北京高考作文
细胞在6孔板中的盖玻片上生长，然后在不存在或存在LPS的情况下用OPC处理。 细胞用4％多聚甲醛固定，然后在0.1％TritonX-100中透化，然后用PBS中10％山羊血清封闭。 之后，将细胞在第一抗体中在4℃下孵育过夜，然后进行FITC-缀合的第二抗体孵育。 用含有DAPI（Abcam）的荧光载体培养基安装细胞，然后将Olympus BX53荧光显微镜或Olympus FluoViewTM FV10i共焦激光扫描生物显微镜显像。
2.6。 统计分析
数据以平均值表示？ 标准差（SD）。 通过单因素方差分析（ANOVA）评估统计学意义。 显着性水平（P值）小于0.05。 所有统计分析均使用GraphPad Prism v6软件（Graphpad Software Inc.，USA）进行。
3.结果
中山大学 bbs3.1。 OPC抑制LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物
首先，我们确定了HSC-T6细胞的活力。 OPC（0-40mg / ml）在24小时内浓度依赖性降低HSC-T6细胞活力（图1A）。 OPC的IC50为54.20mg / ml。 LPS统计增加HSC-T6细胞活力，这与以前的报道一致[25,26]，表明LPS可以刺激HSC的活化。在LPS存在下用OPC处理的HSC-T6细胞也表现出细胞活力下降的趋势（图1B）。据报道姜黄素通过抑制HSC活化来保护肝纤维化，并且对肝纤维化具有很高的意义[27,28]。正在进行一系列临床研究以研究姜黄素对人类肝脏疾病的影响（v）。因此，我们使用姜黄素作为阳性对照，我们也在以前的研究中使用姜黄素作为阳性对照[29]。 OPC在20和40mg / ml的共振中表现出与HSC-T6细胞中的姜黄素相当的细胞毒性，表明OPC具有HSC活力的潜在抑制特性。为了证实OPC的抗纤维化作用，我们确定蛋白M.Giang等。 通过蛋白质印迹法分析胶原蛋白I，SMA和TIMP-1的表达.LPS处理增加肝纤维化标志物，如胶原I，a-SMA和TIMP-1，而用OPC预处理 在LPS之前，以浓度依赖性方式抑制LPS诱导的肝纤维化标志物蛋白表达增加（图2A和2B）。 我们的数据证实，通过OPC抑制ECM生
成可能与降低的HSC增殖有关。图1. OPC对HSC-T6细胞活力的影响。 在不存在（A）或存在（B）LPS的情况下，用不同浓度的OPC或姜黄素预处理HSC-T6细胞24小时。 ＃P <0.5，### P <0.001，与未处理的HSC-T6细胞相比有明显差异; *** P <0.001，与LPS处理的HSC-T6细胞相比显着不同。
3.2。 OPC抑制激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化
由于参与肝纤维化的MAPK信号通路的重要作用，我们分析了OPC对JNK和ERK磷酸化的影响。 用OPC（5,10,20和40mg / ml）处理30分钟，我们发现LPS刺激后磷酸化的ERK和JNK显着增强，但是通过OPC处理和浓度有效地降低了这些MAPK蛋白的磷酸化水平 （图3）。 为了证实OPC的抗纤维化机制是否涉及PI3K / Akt信号通路，我们进行了磷酸化和总PI3K和Akt蛋白的Western印迹分析。 在LPS刺激的HSC-T6细胞中发生PI3K / Akt的磷酸化。 磷酸化PI3K / Akt蛋白水平通过OPC浓度依赖性降低。
图2. OPC对LPS激活的HSC-T6细胞的肝纤维化标志物的影响。 HSC-T6细胞在LPS激活另外24小时之前用OPC预处理1小时。 （A）使用western印迹检测a-SMA，胶原I和TIMP-1的蛋白表达。 （B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。 *** P <0.001，与LPS
激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。 ### P <0.001，与正常未处理的HSC-T6细胞相比有显着性差异。
图3. LPS激活的HSC-T6细胞中的ERK / JNK MAPK和PI3K / Akt磷酸化。 HSC-T6细胞在LPS刺激前1小时预处理30分钟。 （A）通过用特异性一级抗体的Western印迹测量磷酸化和总JNK，ERK，PI3K和Akt蛋白。 （B）每个条带被数字化并归一化为b-肌动蛋白水平。 *** P <0.001，与LPS激活的HSC-T6细胞相比有显着差异。 ### P <0.001，与正常未处理的HSCT6细胞相比有显着性差异。
急医疗3.3。 OPC阻断LPS刺激的HSCT6细胞中的NF-kB核移位
NF-kB是LPS刺激的HSC-T6细胞中促炎介质生产中的关键上游调节因子。 我们调查了OPC是否可以阻止NFkB的核易位。 首先，使用western blot检测核和细胞溶质级分中的NF-kB p65亚基。 NF-kB p65在LPS刺激后30分钟内降低，而NF-kB p65表达增加（图4A和B）。 核和细胞质分数的这些变化表明，HSC中的LPS刺激后，NF-kB p65从胞质溶胶转移到核。 据预期，OPC成功抑制了细胞质中NF-kB p65表达的降低，核增加。 我们还观察到LPS刺激后30分钟，NF-kB p65明显移位到HSC细胞核中（图4C）。 然而，与LPS引
发的HSC-T6细胞相比，OPC预处理显着抑制NF-kB的核易位。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议