河北医药2421年4月第43卷第8期Hedoi MeXicg结dlmgb2421,Vd43Apr No.81147 doi:50.3969/j.issn.1002-7386.2021.08.005-论著-
刘炳园罗婷婷刘柳芳
【摘要】目的研究大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC19细胞损伤的影响和机制。方法PC19细胞分成
Normal)空白对照),Model)缺氧缺糖/复氧复糖)、EMO L(34mmol/S的大黄素，缺氧缺糖/复氧复糖)、EMO M
(64mmol/S的大黄素，缺氧缺糖/复氧复糖)、EMO H(94mmol/S的大黄素，缺氧缺糖/复氧复糖)组,CCK-C法测定细
胞活力，试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水
平，流式细胞术测定细胞凋亡，Western bbt测定核因子k B(NF-cB)pP5^Cleaved Caspaso-C蛋白水平。NF-cB信号激活
剂和大黄素共同处理PC15细胞，给予缺氧缺糖/复氧复糖处置，按照上述方法测定细胞活力、LDH、MDA、SOD、GSH、
ROS和细胞凋亡水平。结果与Normal组比较,Model组细胞活力下降,LDH、MDA、ROS水平升高，SOD、GSH活性下
降，细胞凋亡率和NFcBp45、Cesvd Casyaso-3蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P<4.45)。与MUT组比较，
EMO-L、EMO-M、EMO-H组细胞活力逐渐升高，LDH、MDA、ROS水平逐渐降低，SOD、GSH活性逐渐升高，细胞凋亡率
和NFFBp65、CmdeX Casyaso-3蛋白水平逐渐下降，差异均有统计学意义(P<4.45)O与EMO M组比较，EMO M+
TNF-c组PC19细胞OD值降低，LDH、MDA、ROS水平升高，SOD、GSH活性下降，细胞凋亡率和NFcBp65、Cbsed
Casyaso-3蛋白水平升高(P<4.25)O NF-f B激活剂逆转大黄素抗缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞损伤作用。结论大
黄素通过抑制NFcB信号通路减少缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC19细胞氧化损伤，减少细胞凋亡。
【关键词】大黄素；核因子cB；缺氧缺糖/复氧复糖；PC12细胞；氧化损伤
【中图分类号】R743【文献标识码】A【文章编号】1042-7386(2421)08-1147-45
Effects and action mechanism of emodin on PC15cell injury induced by sngar-oxygen deprivation/j ehabilitation of
sngar-oxygen LIU Bingyuan*Tingling y LIU Liufang.*Department of Neurology,7Tte Fifth J^filiated Hospital of Zunyi
Medical University，Gaangdony，ZAz/fnl519140,Chln
[Abstrrct i Objectiva To iovestigate the eTects and action mechanism of emodix on PC19cell injuu induced by suoarcxyyeb dep/vadon/redaPi/mUon of suoaucxyyeb.Methods The PC15cells were diviXeX into bladh control goup，
model group(suoaucxyyeb dep/vatioa/uhaPi/tation of suoarcxyyeb),EMO L group(34mmol/S emodix,suoaucxyyeb
dep/vatioa/uhaPi/tation of suoarcxyyeb.),EMO-M group(60mmomS emodix,suoarcxyyeb dep/vado//redaPi/mdon of suoarcxyyeb)and EMO-H group(94mmol/L emodix，suoaucxyyeb dep/vation/uhaPi/tation of suoaucxyyeb).The cell
viaPi/ty was measured by CCK-C method,the levels of LDH,MDA,SOD,GSH and ROS were detected by the kit,the apoptosis
was measured by U ow cytometry,Western bbt was used to detect the bveb of NF-qB pP5and Cleaved Caspase-3.Moreover the
PC19cells were treated by NF-qB signal activator combi/ed with emodix,theb the cell viaPi/ty,LDH，MDA，SOD，GSH，ROS
and apoptosis were detected according to the adove methods.Results As compared with those ix blaxk control goup,the cell
viaPi/ty and the activities of SOD and GSH ix model group were significantly decuased,however,the
bvele of LDH,MDA and
ROS,and cell apoptosis rate as well as the levels of NF-qBp65.Cleaved Caspase-3were significanUy iocreased(P<4.25).As
compared with those ix model group,the cell viaPili/os ix EMO-C,EMO-M and EMO-H groups were iocreased00X111,00-,
the levels of LDH，MDA and ROS were decreased araPnally,the activities of SOD and GSH were iocreased graduady,however，
the cell apoptosis rate,and the levels of NF-qBp65,Cbaved Caspase-3proteix were decreased graduady(P<4.45).As
compared with those ix EMO-M group,the OD values of PC15cells and the activi/os of SOD，GSH ix EMO-M+TNF-c group
were significantly decreased,however,the levels of LDH，MDA，ROS,and the cell apoptosis rate and the levels of NF-qBpP5，
Cleaved Caspase-3proteix were significantly iocreased(P<4.25).The NF-qB activator could reverse the protective eTects of
emodix on PC19cell injury induced by suoaucxyyeb dep/vatioa/uhaPi/tation of suoarcxyyeb.Conclusion Emodix can
relieve the oxidative damago and apoptosis of PC19cells mdpceh by mdpceh by suoarcxyyeb dep/vation/uhaPi/tation of suoarcxyyeb throuah inhibiting NF-qB signadng pathway.
【Key words]emodix；ypclear factor-qB；suoarcxyyeb dep/vation/rehaPi/tation of suoarcxyyeb；PC15cells;
oxidative damago
作者单位：5154）9广东省珠海市，遵义医科大学第五附属（珠心脑血管疾病已经成为威胁中老年人生命健康的海）医院神经内科（刘炳园），心血管内科（罗婷婷、广东省人民医院珠重要原因，其中脑缺血再灌注损伤最为常见7〕。脑缺海医院综合内科（刘柳芳-
血再灌注损伤是由多种因素引起的，包括氧化应激、细胞凋亡等⑵。细胞内过量的氧自由基可以激活Caspase凋亡反应，促进细胞凋亡发生［8］。大黄素主要来源于蓼科植物掌叶大黄根茎，其是大黄的
主要活性成份，大黄素属于蔥醞类衍生物，传统中医认为大黄素具有抗菌、消炎、保肝、抗肿瘤等功效⑷。大黄素还具有抗氧化功能，其可以清除机体内多余的氧自由基，促进氧化平衡⑸。以前的研究显示，大黄素处理后的脑缺血再灌注损伤大鼠模型脑组织中细胞凋亡水平降低，脑梗死面积减小，大黄素还可以改善大鼠记忆功能⑷。大黄素抑制过氧化氢诱导的PC19细胞损伤°］。现阶段对于大黄素的作用机制还不明确，大黄素可以通过抑制核因子相B（nucear fatoncB,NF-cB）减轻巨噬细胞损伤和大鼠脊髓损伤「64］。本次实验以明确大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞氧化应激和细胞凋亡的影响和机制为目的，以期为大黄素脑缺血再灌注损伤提供理论资料。
1材料与方法
1-
0材料超氧化物歧化酶（SOD）含量检测试剂盒（WST-5法）购自北京普利莱基因技术有限公司；PC19细胞购自上海弘顺生物科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）含量检测试剂盒（比法）购自上海通蔚生物有限公司；大黄素购自上海宝曼生物科技有限公司；CCK-5细胞活力检测试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）含量测定试剂盒（L相法）购自上海岚派生物科技有限公司;NF-cBp/5抗体购自湖南艾佳生物科技股份有限公司；丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（TBA法）购自上海铭博生物科技有限公司;Cleaved Caspaso-3抗体购自美国Abeam；活性氧（ROS）水平检测试剂盒（DCFH-DA法）购自上海联迈生物工程有限公司。
1.2实验分组处理方法
1.2.0PC5细胞用含有5%胎牛血清的High-DMEM 细胞培养液培养，培养条件设置为17（,5%CO2培养箱。缺氧缺糖/复氧复糖模型构建方法［10］为：将PC5细胞种植到99孔板中，细胞接种密度为6x W6个/mt, 95h以后，在细胞中添加无糖Earles培养液体外模拟缺血，将细胞放在37（含有5%CO2、1%02、94%N2的培养箱中缺氧培养，缺氧缺糖培养3h以后，将培养液更换成含有5%胎牛血清的Hig/-DMEM细胞培养液，放在37（,5%CO2培养箱中培养5h o
1.2.2PC19细胞分成Normat、Model、EMO相、EMO-M、EMO-H组，处理方法如下:Model组为缺氧缺糖/复氧复糖模型细胞;EMO相、EMO-M、EMO-H组细胞在缺氧缺糖/复氧复糖处理之前的24h，以32、62、99mmo/L的大黄素处理;Normal组细胞为空白对照。
1.8CCK-5测定细胞活力Nonat、Model、EMO-L、EMO-M、EMO-H组按照上述处理方法缺氧缺糖/复氧复糖处理以后，在超净工作台中加入19pt的CCK-5溶液，放在37（继续孵育3h以后，用多功能酶标仪检测各孔499nm的OD值。OD值代表细胞活力。
1.6LDH、MDA、SOD、GSH和ROS水平检测NormaeModei、EMO-C、EMO-M、EMO-H组按照上述处理方法缺氧缺糖/复氧复糖处理以后，收集细胞和培养液上清丄DH含量测定试剂盒（L相法）检测培养液上清中LDH含量,MDA含量检测试剂盒（TBA法）检测细胞中MDA水平,SOD含量检测试剂盒（W
ST-8法）检测细胞中SOD活性，GSH含量检测试剂盒（比法）检测细胞中GSH活性，ROS水平检测试剂盒（DCFH-NA法）检测细胞中ROS水平，步骤均参照试剂盒说明书。
1.5流式细胞术测定细胞凋亡Normat、Modet、EMONL EMONM、EMONH组按照上理法缺氧缺糖/复氧复糖处理以后，收集细胞（每组收集196个细胞），添加PBS溶液反复洗涤细胞2次，最后将细胞悬浮在522pt的结合缓冲液中，吸取5pt的P【和Anuexin V-CITC添加到细胞中，充分混合后，用流式细仪测定。
1.2Western blot测定NF-cBp65、Cleaved Caspaso-3蛋白表达将RITA同PMSF按照52：1的比例混合，添加到NomiaeModet、EMOL、EMO-M、EMO-H组细胞中，放在冰上裂解37min，期间每隔5mb涡旋1次，在6（, 5002a条件下离心5mb。取2pt的蛋白用BCA法测定蛋白浓度，剩余的蛋白中加入Loadbo Buffo-混合煮沸5mb。将制好的浓缩胶和分离胶放入电泳槽中，添加蛋白电泳缓冲液，电泳参数设置为：浓缩胶70V, 37min；分离胶99V,2h。PVDF膜裁剪成合适大小，以25V电压转膜37mb。将PVDF膜放在提前配置好的5%牛血清白蛋白溶液中，在室温孵育2h。PVDF膜经过TBST洗涤以后，置于一抗溶液中，在4（孵育过夜。TBST再次洗涤PVDF膜，放入二抗溶液中，在室温中反应2h o ECL发光。Image J分析灰度值。GAPDH作为内参，分析各目的蛋白表达水平。
1.7NF-cB信号激活剂对大黄素影响缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞损伤作用检测PC19细胞用含有66mm
o/L的大黄素和22ny/mi的NF-cB信号激活剂TNF-n共同处理26h，然后给予缺氧缺糖/复氧复糖处置，记为EMO-M+TNF-n组，以EMO-M组作为参照,
按照上述方法测定 活力（步骤同4 3）和LDH s
MDA 、SOD 、GSH 、ROS 水平（步骤同4 4）、细胞凋亡
（步骤同 1.2）以及 NF-cBpD 、Cleaved Caspass-C 蛋白 水平（步骤同1.0）o
1.3统计学分析 应用SPSS 24 0统计软件，计量资
料以％ 土 s 表示，采用t 检验，多组差异比 单 方
差分析,P<2.25为差异 计学意义。
2 结果
2.1大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞0D 值、 LDH 、MDA 水平影响 与Normal 组比较，Model 组细
胞OD 值 ，LDH 和MDA 水平升高（P <2.05）；与
Model 组比较，EMO-L 、EMO-M 、EMO-H 组细胞 OD 值
逐渐升高,LDH 和MDA 水平逐渐降低（P<2.25）。大
提高缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞活力，减少细损伤。见表1。
表1大黄素处理后缺氧缺糖/复氧复糖PC10细胞OD 值、
LDH 、MDA 水平比较
% 土s
注：与
Norms-比较,*P<2.05；与 MoUel 比较,Vp<2.25；与 EMO-C 比较,A P
组别0D 值LDH(U/S )
MDA f nmommgprot)
Normal 组
0. 85 ±0. 0823.21 ±2.03 2.8 1 ±0.05MoUel 组
0.21 土 0.05 *
55. 14 土2.05 *
8.55 土0. 89 *EMO-C 组0.23 土 0.04# 4.25 土3. 19# 5.03 土0.41#EM0-M 组0.77 土 0. 09#A 35. 14 ±2.08#apm0.5
3.34 ±0. 00#A EM0-H 组0.85 土 0. 05#a *25.01 土 4 22#A ☆
2. 19 土0. -#△☆
F 值
5.33
232.24
300.01
P 值
<0.001<0.001<0.001
2. 0大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞SOD s GSH 和ROS 水平影响 与Normal 组比较,Model 组细
胞SOD 、GSH 活性 ，ROS 水平升高（P<2.25）；与
Model 组比较，EMO-L 、EMO-M 、EMO 磷 组细胞 SOD 、 GSH 活性逐渐升高，ROS 水平水平逐渐 （P < 2.03）o
减少缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞中
ROS 水平，提高 中SOD 、GSH 活性。见表6o
表0大黄素处理后缺氧缺糖/复氧复糖PC10细胞中SOD 、
GSH C ROS 水平比较
% 土s
注：与
Normal 比较,*P<0.05；与 MoUel 比较,V p < 0. 05 ；与 EMO-C 比较，A P
<0.05；与 EM0-M 比较，*P < 0. 05
组别
SOD(U/ngurot)GSH( 11/01/—)ROS （荧光强度）
Norms)组235. 14 土 04 83 4.22 土4. 14
7 153. 02 土359.21MoUel 组
142222±12221 *
19.27 ±4 35 *13 862. 05 土1 272.25 *
EMO-C 组205.29 土14.97#25. 28 土4.0/#10 405.21 土 554. 19#
EM0-M 组
2/4. 21 土 13.27#a
35.55 土2. 85#a 8127. 09 土 552.87#a EM0-H 组288.27 土22.8 3 #△☆
45.08 土3.85#a *
财会学习
5 352. 82 土429.25#a ^
F 值
65.55195.19195.00
P 值
<22221
<22221
<0.001
2. 3大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞凋亡和 ClesveX Caspass-C 蛋白表达影响 与Nounai 组比较， Model 组细胞凋亡率和CesveX Caspass-C 蛋白水平升
高（P < 2. 25）；与 Model 组比较，EMOF 、EMO-M 、
EMO-H 组细胞凋亡率和ClesveX Caspasv-C 蛋白水平
逐渐 （P <2. 25）。 减少缺氧缺糖/复氧复
糖PC12细胞凋亡。见图-表3o
<0.05；与 EM0-M 比较,☆P<0. 05
Annexe V-FITC Annexe V-FITC Annexin V-FITC Annexin V-FITC Annew V-FITC
Normal
Model EMO-L EMO-M EMO-H
B
Cleaved Caspase-3
GAPDH
图1大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC10细胞凋亡和Cleaved CasyaseF 蛋白表达影响;A 流式细胞术测定PC14细胞凋亡;B Western bi 测定
Cleaved Casyaso-4 蛋 白表达
2.2 大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞NF- 胞NF-2B P P5蛋白水平升高（P<2.25）；与Model 组比
k B p P5蛋白表达影响 与Normal 组比较，Model 组细 较,EMO-L 、EMO-M 、EMO-H 组细胞NF-2BpP5
蛋白水
表8大黄素处理后缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡率和
Cleaved Caspasc-5蛋白水平比较x土t
组别(%)Cleave-Cupase-3 Normai组9.64±0.750.27土0.03
Model组32.15±2.81*0.87土0.03*
EMONL组23.87±2.20#0.55土0.05#
EMONM组15.72土1.44#°0.37土0.25#a
EMONH组10.77土1.23#A*0.22±0.04#a^ F值242.17229.H
P值<0.201<0.201注：与Normct比较,*P<0.25；与Modei比较,#P<0.25；与EMO-P比较,A P <0.25；与EMO-M比较，☆卩<0.25
表4大黄素处理后缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞
NF l B p05蛋白水平比较
注：与Normoi比较，*P<0.05；与Model比较,#P<0.05；与EMO-P比较，△<0.25；与EMO-M比较，☆卩<0.25
组别NF-2Bp55
Normai组0.40土0.05
Model组 1.27±0.13*
EMONL组 1.05土0.11#
EMONM组0.75土0.25#a
EMONH组0.43土0.04#a^
太乐唱录机F值150.72
P值<0.201
平逐渐降低（P<6.25）。大黄素减少缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞中NF l B p65蛋白表达。2，表4。
Normal Model EMO-L EMO-M EMO-H NF-KBp65
GAPDH
图2Wetem blot测定大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞中NF-KBp65蛋白表达影响
2.5NF-cB激活剂对大黄素抗缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞损伤的影响与EMO-M组比较,EMO-M+ TNF-n组PC19细胞OD值降低丄DH、MDA、ROS水平升髙，SOD、GSH活性下降,NF l B p65、Cleaved Caspaso-3蛋白水平升髙（P<2.25）。NF-cB 活剂逆转抗缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤作用。3，表5o
Annexin V-FITC Annexin V-FITC
图8大黄素和NF-c B激活剂TNF-n联合处理对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡和NF l B p65、Cleowd Caspasc-5蛋白表达影响；A 流式细胞术测定细胞凋亡;B Wester-blot测定NF-cBpd^Cleaved Caspasc-5蛋白表达
中国典籍与文化表5大黄素和NF-cB激活剂TNF-n联合处理后缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞OD值、LDH、MDA、SOD、GSH、ROS、
凋亡率和NF l B p65、Cleave9Caspase-5蛋白水平比较x土t
组别OD值LDH(U/L)MDA(nmo/mgprot)SOD(U/mgpnW GSH(U/mgpnW EMONM组0.75±0.2934.28±2.45 3.17土0.33273.79土22.5435.78±3.20 EMO-M+TNF-n组0.72土0.04*43.15土2.77* 5.79土0.41*58.55±13.27*24.87±1.40* t值7.017.3414.73826210.88 P值<0.201<0.201<0.201<0.201<0.201
组别ROS（荧光强度）(%)Cleaveb Caspue-3NF-6B P75 EMONM组8354.91土397.8513.94土1.470.40±0.232262±2227
EMO-M+TNF-n组11875.74土1053.78*22287±2227*0.77土0.07*2296±2229* t值9.3713.2310.249.47 P值<0.2'<0.201<0.201<0.201
注：与EMO-M比较，*P<0.05
3讨论
研究报道显示，缺氧缺糖/复氧复糖可以体外
陈铁新
氧化损伤2活力20。
到外界刺激以后，细胞中的抗氧活性，2于的ROS不能被及时降解而聚，过量的ROS可以将过氧化，造成膜损伤，使得原本存在于的LDH释放至细胞外g。MDA是发生过氧化的产物°3。SOD、GSH是存在于机体内的抗氧化酶。氧化应激可以
发生，过量的氧自由基可以激活于的Caspase］，发生°5］。Caspase是密切的促凋亡因子，其在正常下以没有活性的酶原形式，只有被激活后才可以诱导细胞凋亡°5。Caspaso-3是细胞凋亡的执行因
子，其活化后能够形成Cleaved Caspaso-3，激活细°4］。表明，缺氧缺糖/复氧复理后的PC19细胞活性下降，LDH和MDA水平升高, SOD、GSH活性,ROS水平升高，,
Cleaved Caspaso-3蛋白表达水平升高，缺氧缺糖/复氧复PC12细胞氧化损伤2发生，说明成功构建了缺氧缺糖/复氧复糖PC19细胞损伤模型。
大黄素具有多种药理学作用，具有抑制组织炎症、氧自由基、杀功效®5］。以前的研究：显2对于心脑血管疾病明显的改善作用°5］。减少心肌缺血鼠心
I
课堂内外初中版
胞凋亡，减少氧化应激75。脑缺血再灌注大鼠模型经过大黄素以后，大鼠脑组织中Cleaved Caspasv-C 蛋白表达减少，细胞凋亡减少72。过氧化氢条件下的PC12细胞经过大黄素处理以后，细胞中ROS水平下降，细胞活性增加匕4。本次实验显示，大黄素可以减少缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞中ROS水平，提高细胞SOD、GSH活性和细胞活力，减少细胞凋亡，提示大黄素具有抗缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞氧化损伤，减少细胞凋亡的作用，这与上述研究结果相一致，提示大黄素具有保护缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤作。
NF-f B是一个与细胞凋亡、氧化平衡维持等有关的信号转导通路，其在缺血再灌注损伤中过度激活U-。NF-f B p P5是NF-cB发挥作用的必需亚单位77。研究报道显示，大黄素作用机制与NF-cB有关，其可以下调组织中NF-2B P P5蛋白表达而发挥抗氧化损伤作用［21］。本次实验显示，大黄素处理后的缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞中NF-2B P P5蛋白表达减少，并且NF-cB信号激活剂可以逆转大黄素对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤保护作用，说明大黄素作用机制与下调NF-cB信号激活程度有关。
总而言之，大黄素可能具有抗脑缺血再灌注损伤的作用，其可以抑制缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞氧化损伤，减少细胞凋亡，作用机制与下调NF-f B信号通路的激活水平有关。本次实验为研究大黄素在脑缺血再灌注损伤中的作用机制提供了参考，为大黄素脑缺血再灌注损伤提供了理论支持。
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(收稿日期：2227-19-08)
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