开课实验室：环境资源楼312
【实验目的】
1、熟悉荧光分析法的基本原理；
2、了解RF–5301型荧光分光光度计的构造、原理，掌握荧光分析法的基本操作；
3、掌握荧光分析技术应用于定量分析的原理及方法。
【基本原理】
•原理概述：利用荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至激发态的任一振动能级，在溶液中以热的形式损失部分能量后回到第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。hdn
•荧光的产⽣生：荧光物质分子在吸收特定频率辐射能量后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而
回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。能产生强荧光的物质分子，一般都具有大的共轭π键结构或具有刚性平面结构等特征。
•荧光分析法的特点：
优点：灵敏度高、选择性好、工作曲线线性范围宽，能提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、荧光偏振等诸多信息；
缺点：由于能够产生强荧光的物质相对较少，荧光分析法的应用不太广泛；
改进：对于没有强荧光或没有荧光的物质的测定可设计相应的反应使其生成具有荧光特性的配合物进行测定。•氨基酸：含有氨基和羧基的一类有机化合物，是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有能发射荧光的组分，可以用荧光法测定。 【仪器与试剂】
1、仪器：F-4600型荧光分光光度计，10 mL带玻璃塞的比10只，分度吸量管
图1 荧光光谱仪结构示意图ssf
2、试剂：标准溶液a：4×10-4mg/mL的酪氨酸溶液；
标准溶液b：1×10-3mg/mL的苯丙氨酸溶液；
标准溶液c：1×10-3mg/mL的氨酸溶液；
中国统计年鉴2008植兰氨酸待测样；去离子水。
【实验步骤】
（1）分别移取标准溶液a、标准溶液b和氨酸待测样于10 mL比管中，待用。
（2）分别移取0.00、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL标准溶液c于5个10 mL比管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。
2、仪器操作：
（1）打开计算机和分光光度计主机，双击分光光度计图标“FL-Solutions”，等系统自检结束。预热15-30分钟。
待仪器稳定后方可使用。
（2）选择光谱测量界面（“Method”—“General”—“Measurement”—“Wavelength scan”），绘制上述步骤（1）中各溶液的激发光谱和发射光谱，并确定各自的λEmmax和λExmax。
五笔字型练习（3）选择定量测定界面（“Method”--“General”--“Measurement”--“photometry”），依据上述步骤中测得的酪氨酸的λEmmax和λExmax，设定定量测定的参数，测定系列标准溶液的荧光强度Is值，然后在相同条件下测量未知样的相对荧光强度I x，并记录实验数据。
【数据记录与实验结果分析】
1、氨酸的荧光分析：
调整狭缝宽度至最佳值：d ex=6.0nm，d em=4.0nm。首先预扫。
取λEm=354nm，得到激发光谱如图2：
图2 氨酸的激发光谱
选择最大强度对应的波长约220nm处，得到氨酸的发射光谱：
图3 氨酸的发射光谱
由图得，氨酸的λEmmax为354nm。
2、酪氨酸的荧光分析：
调整狭缝宽度至最佳值：d ex=6.0nm，d em=4.0nm，首先粗扫，λEm=307nm时，得到激发光谱如图4：
图4 酪氨酸的激发光谱
图5 酪氨酸的发射光谱
由图得，酪氨酸的λEmmax为307nm。
3、苯丙氨酸的荧光分析：
调整狭缝宽度至最佳值：d ex=8.0nm，d em=6.0nm，首先粗扫，λEm=306nm时，得到激发光谱如图6：
长泾中学
图6 苯丙氨酸的激发光谱
图7 苯丙氨酸的发射光谱
由图得，苯丙氨酸的λEmmax为307nm。
4、将测得的苯丙氨酸、酪氨酸和氨酸溶液的发射光谱叠加在一个坐标系中：
从图8可知，苯丙氨酸和氨酸的最大激发波长均在307nm左右，酪氨酸的最大激发波长在354nm左右。
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