宋福如
Vol.42 2021年3月
No.3
758~766 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES
高等学校化学学报
齐人睿1，李明昊1，常浩2，付学奇1，高波1，韩葳葳1，韩璐1，李婉南1
（1.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，生命科学学院，长春130012；
2.吉林省特医食品生物科技有限公司，长春130052）
摘要采用拉伸分子动力学模拟的方法研究了黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XO)抑制剂别嘌呤醇(Allopuri⁃
nol)和葛根素(Puerarin)从XO离去通道解离的动态过程.分子对接结果表明，别嘌呤醇和葛根素均结合在XO 的钼蝶呤中心(Molybdopterin,Mo-pt)；丙氨酸扫描的结果显示,Val789,Arg880,Phe911,Phe914和Val1081在XO
与抑制剂的结合中起到非常重要的作用.拉伸分子动力学模拟结果显示，相比于葛根素，别嘌呤醇需要更大的
外力和更长的时间才能从XO中解离，拉伸过程中Arg880,Phe1009,Thr1010,Val1011和Ala1079均对维持2种
复合物的结构稳定起到重要作用,Phe649和Phe1013在抑制剂解离过程中起到门控的作用,His875起到阻碍
抑制剂解离的作用.
关键词黄嘌呤氧化酶；别嘌呤醇；葛根素；痛风；拉伸分子动力学模拟
中图分类号O641文献标志码A
痛风的临床症状有高尿酸血症、肾尿酸结石、慢性肾炎以及关节畸形和慢性关节炎，给患者造成极大的痛苦［1，2］.痛风是由嘌呤代谢紊乱导致尿酸沉积在组织中而引发的慢性疾病［3］.嘌呤代谢过程中产生的黄嘌呤和次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶（XO）的氧化作用下生成尿酸，是导致尿酸在体内堆积的主要原因之一.目前，黄嘌呤氧化酶的抑制剂是用于痛风及高尿酸血症的主要药物，因此黄嘌呤氧化酶与抑制剂的相互作用是一个研究热点.
XO是一种复合型的核黄素蛋白，由两个完全重复对称的结构单元组成，每个结构单元由3条异源的肽链组成［图1（A）］，其催化中心包括一个黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，FAD）、两个铁-硫中心（Iron-sulfur centers，Fe/S I，II）以及一个钼蝶呤中心（Molybdopterin，Mo-pt）.图1（B）给出了黄素腺嘌呤二核苷酸（C27H33N9O15P2，FAD）、MTE（Phosphonic acidmono ester，C10H14N5O6PS2）、鸟嘌呤（Guanine，C5H5N5O）、MOS（Dioxothiomolybdenum ion，HMoO2S）和铁硫簇（Fe2S2cluster，FES）5种小分子配体的三维（3D）结构，其中鸟嘌呤，MOS及MTE结合在由氨基酸残基Phe767，Phe798，Gly800，Glu802，Gly876，Arg880，Ala910，Phe911，Phe914，Thr1077，Ala1078，Ala1079，Ser1080，Val1081及Ser1082组成的钼蝶呤中心口袋［图1（C）］，FES结合在由氨基酸残基Lys40，Leu41，Gly42，Cys43，Gly44，Gly46，Ala50，Cys51，Asn71，Cys73，Ser111，Gln112，Cys113，Phe115，Cys116，Cys143，Cys148，Cys150及Thr151组成的铁-硫中心口袋［图1（D）］，FAD结合在由残
基Asn251，Lys256，Leu257，Val258，Val259，Gly260，Asn261，Thr262，Val342，Ser347，Asp360，Leu398，Glu402，Ile403，Leu404及Arg426组成的黄素腺嘌呤二核苷酸中心口袋［图1（E）］.而钼蝶呤中心是黄嘌呤氧化酶催化底物产生尿酸的关键位点［4，5］，在黄嘌呤的氧化过程中，Mo（Ⅵ）被还原为Mo（Ⅳ），产生的电子经由FAD和Fe/S传递给氧分子，与氢离子结合形成过氧化氢，Mo（Ⅳ）则再氧化为Mo（Ⅵ）［6］.
别嘌呤醇（Allopurinol）的结构与黄嘌呤相似，可以竞争性抑制黄嘌呤氧化酶［7］，使黄嘌呤氧化酶不
doi：10.7503/cjcu20200752
收稿日期：2020-10-16.网络出版日期：2021-01-13.
基金项目：吉林省科技发展计划项目(批准号:20200801069GH)资助.
联系人简介：李婉南，女，博士，副教授，主要从事抑制剂筛选、蛋白质与抑制剂相互作用研究.E-mail:****************
No.3齐人睿等：基于拉伸分子动力学模拟的黄嘌呤氧化酶抑制剂解离途径的理论研究能催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸，从而降低了尿酸在体内的沉积，是高尿酸血症的主要药物，但其具有恶心、
头痛、白细胞减少或增多等一系列副作用［8~10］.有研究表明，属于异黄酮类化合物的葛根素（Puerarin ）对黄嘌呤氧化酶表现出较好的抑制效果，属于温和性的竞争型黄嘌呤氧化酶抑制剂，能
够明显降低高尿酸血症患者血清中的尿酸水平［11~13］，
有望被开发为新的痛风的药物，但是关于抑制剂与黄嘌呤氧化酶解离途径之间的相互作用却鲜有报道.本文通过对XO/allopurinol 和XO/puerarin
2种复合物进行拉伸分子动力学模拟，从计算生物学的角度解释黄嘌呤氧化酶与抑制剂的结合方式，以及抑制剂从黄嘌呤氧化酶上解离的过程.1计算模拟方法
1.1模拟体系准备
WNVTK
蛋白质的初始结构为XO （PDB ID ：3NVW ）［14］.从Chemspider 数据库中下载Allopurinol 和Puerarin 的几何结构，底物初始结构采用Gaussian 09软件包，在B3LYP 6-31+G *基组水平上进行优化［15］.优化后结构的分子轨道使用Multiwfn 程序［16］显示.采用AutoDock Vina ［17，18］对接构建XO/allopurinol 和XO/puerarin 2种复合物的结构.1.2XO 蛋白通道预测
采用CAVER 3.0软件，分别对2种复合物的10ns 常规分子动力学模拟轨迹产生的1000个快照进行配体解离通道的预测［19］.设置每个构象中识别出的通道瓶颈半径
国际枕头大战日（Bottleneck radiu ）≥0.12nm ，聚类阈值（Clustering_threshold ）为7.5.由于在同一构象中可能会识别出多条几乎同轴线的通道，为了去除多余通道，则保留每个构象中能量最低通道（One_tunnel_in_snapshot cheapest ）.
1.3拉伸分子动力学模拟
依据CAVER 3.0得到的结果，确定配体解离通道及其拉伸方向，蛋白采用GROMACS 软件中AMBER99SB -ILDN 力场，小分子力场参数由GAFF 程序生成，进而实施拉伸分子动力学模拟［20，
21］.在进行拉伸分子动力学模拟之前，将分子对接得到的2个复合物分别放入到两个周期性边界为1nm 的立方
体盒子中，盒子中除蛋白外的位置采用TIP3P ［22］水模型填充，
以车代磨其中在含有别嘌呤醇的体系中添加57349个水分子，在含葛根素的体系中添加57340个水分子.为了保证电荷的平衡，向2
个模拟体系中均添加Fig.1Overview of xanthine oxidase(XO,PDB ID:3NVW)
(A)3D structure of XO;(B)3D structures of FAD,MTE,Guanine,MOS and FES;(C —E)binding pocket for MO⁃pt,Fe/S and FAD,respectively.
759
Vol.42高等学校化学学报5个Cl ‒.在进行拉伸分子动力学模拟时，首先使用最陡下降法对模拟体系进行50000步的能量最小化，然后再进行100ps 的恒温恒容（NVT ）模拟和100ps 的恒温恒压（NPT ）模拟.在进行NVT 模拟时，2个体系均采用LINCS 算法［23］约束所有共价键的振动.采用Berendsen 算法［24］控温，将体系的温度保持在300K ，温度耦合常数为0.1ps.采用SETTLE 算法限制水分子的几何构象，范德华相互作用的双程截断半径设为1.0和1.2nm ，长程静电相互作用使用Particle mesh Ewald （PME ）［25］方法处理.在进行NPT 模拟时，采用Berendsen 算法［24］控压，压力耦合的时间常数设为2.0ps ，压力耦合的参考压力设为1×105Pa ，原子的各种参数限制及温度设置均与NVT 模拟相同，NPT 模拟之后体系的密度达到最优状态.限制之后对2个体系进行步长为1fs 、牵引力常数为1000kJ ·mol ‒1·nm ‒2、时长为4000ps 的恒速拉伸分子动力学模拟（0.001nm/ps ）.
1.4平均力势计算
为了研究别嘌呤醇、葛根素与黄嘌呤氧化酶之间的结合能，需要计算一系列伞形采样模拟的平均力势（PMF ）［26，27］.使用伞形偏离势将黄嘌呤氧化酶的质心限制在窗口中，以质心与抑制剂之间的距离作为反应坐标，沿反应轴，每隔约0.1~0.2nm 设置一个伞形采样窗口，其中XO/allopurinol 体系取9个窗口，XO/puerarin 体系取7个窗口，每个窗口独立模拟，首先进行100ps 的NPT 模拟，再进行10ns 的
采样，最终通过使用GROMACS 软件的gmx wham 工具获得PMF 曲线.2
结果与讨论2.1抑制剂结构的优化及与黄嘌呤氧化酶的相互作用
为了得到模拟复合物中合理的抑制剂结构，对别嘌呤醇和葛根素2种抑制剂进行结构优化，研究了它们的化学性质.最高占据分子轨道（HOMO ）与最低未占据分子轨道（LUMO ）之间的能量差称为HOMO -LUMO gap ，可用于预测电子转移的强度和稳定性.其中别嘌呤醇的化学结构及其LUMO 轨道分别见图2（A ）和（B ）；葛根素的化学结构及其LUMO 轨道分别见图2（C ）和（D ）.2种抑制剂LUMO 轨道能量贡献主要位于2个芳香环上，结构与黄嘌呤相似，这可能是2种化合物能竞争性抑制XO 的原因.
采用AutoDock Vina 软件，将别嘌呤醇和葛根素分别对接到黄嘌呤氧化酶中.对接结果显示，XO 的Glu802，Leu873，Arg880，Phe914，Phe1009，Thr1010，Val1011，Ala1078，Ala1079及Glu1261氨基酸残基将别嘌呤醇包裹在中心［图3（A ）］，XO 的Leu648，Phe649，Lys771，Glu802，Leu873，His875，Ser876，Arg880，Ser1008，Phe1009，Thr1010，Val1011，Phe1013，Leu1014，Pro1076及Ala1078等氨基酸残基将葛根素包裹在中心［图3（B ）］.其结果与图1（C ）中鸟嘌呤的结合位置极其相似，由此可见，两者均成功地对接到了XO 的MO -pt 中心.此外，别嘌呤醇和葛根素与活性中心氨基酸形成的氢键可以帮助其更好地结合在XO 的钼蝶呤中心
.
Fig.2Chemical structures(A,C)and population analysis of LUMO orbits(B,D)for
Allopurinol(A,B)and Puerarin(C,D)
760
No.3齐人睿等：基于拉伸分子动力学模拟的黄嘌呤氧化酶抑制剂解离途径的理论研究丙氨酸扫描是指将活性中心的氨基酸突变成丙氨酸，用以分析单个氨基酸残基对蛋白质与配体结合的影响.XO 的丙氨
酸扫描的结果显示，来自于MO -pt 中心的Val789，Arg880，Phe911，Phe914和Val1081突变成丙氨酸之后，XO 与别嘌呤醇之间的结合自由能分别下降了−11.13，−9.67，−16.50，−13.45和−7.60kJ/mol ［图4（A ）］，与葛根素的结合自由能分别下降了−11.97，−10.50，−14.41，
−15.12和−8.44kJ/mol ［图4（D ）］，这种结合自由能下降较为明显的结果说明以上氨基酸在XO
与抑制Fig.3Allopurinol(A)and Puerarin(B)docking to MO⁃pt pocket of XO
2012年中央电视台中秋晚会
The hydrogen bonds were shown by red lines.
Fig.4Computational scanning of the binding site residues in the XO/allopurinol(A―C)and
XO/puearin(D―F)complexes
(A,D)MO⁃pt.a.S1082A,b.V1081A,c.S1080A,d.T1077A,e.F914A,f.F911A,g.R880A,h.S876A,i.E802A,j.G800A,k.V789A,l.Q767A,m.C150A;(B,E)Fe/S.a.T151A,b.C148A,c.F143A,d.C116A,e.F115A,f.C113A,g.Q112A,
h.S111A,i.C73A,j.N71A,k.C51A,l.G46A,L41A,o.L40A;(C,F)FAD.a.R426A,b.L404A,c.I403A,
d.E402A,
e.L398A,
f.D360A,
g.S347A,
h.V342A,
i.T262A,
j.N261A,
保护蔬菜
k.G260A,
l.V259A,
m.V258A.
n.L257A.761
Vol.42高等学校化学学报剂的结合中起到非常重要的作用.此外，来自于Fe/S 结合中心［图4（B ）和（E ）］和FAD 结合中心［图4（C ）和（F ）］氨基酸的突变也能在一定程度上影响XO 与抑制剂的结合.
2.2XO 蛋白通道的分析
在进行拉伸分子动力学模拟之前，利用CAVER 3.0软件预测抑制剂从XO 蛋白上离去的通道，图5显示
了通道的形状及其在XO 中的相对位置.抑制剂从XO 的离去通道位于MO -pt 中心，主要由Leu648，Phe649，Lys771，Ser876，Val1011和Phe1013组成，这些氨基酸在空间结构上形成一个较为规则的近似圆形的通道，且XO 通道的形状也较为规则.蛋白通道的瓶颈半径（Bottleneck radius ）、长度（Length ）和弯曲率（Curvature ）是用于定性分析蛋白质通道的指标，瓶颈半径越大，表示蛋白通道的空间维度越大；长度越短，表示配体从蛋白上解离需要经过的路程越短；弯曲率越小，则配体从蛋白解离的通道形状越平坦.
依据XO/allopurinol 复合物的分子动力学模拟轨迹，得到XO 蛋白离去通道的平均瓶颈半径（Average bottleneck radius ）、平均长度（Average length ）和平均弯曲率（Average curvature ）分别为0.26，1.24和0.12nm ；依据XO/puerarin 复合物的分子动力学模拟轨迹，得到XO 蛋白离去通道的平均瓶颈半径、平均长度和平均弯曲率分别为0.25，0.58和0.12nm.由此可见，抑制剂从XO 蛋白上解离时会经过一个相对较为顺畅的通道，接下来的拉伸分子动力学模拟即基于这条通道进行.从计算结果可见，两个蛋白通路的瓶颈半径和弯曲率相差无几，而通路的长度相差较大，这可能导致相比于葛根素，别嘌呤醇更不易从XO 蛋白中解离.
2.3别嘌呤醇和葛根素从XO 蛋白上解离的过程
为了研究别嘌呤醇和葛根素从XO 蛋白上解离的过程，分别对XO/allopurinol 和XO/puerarin 进行了6次
时长为4000ps 的拉伸分子动力学模拟，表1显示了抑制剂从XO 解离所需要的拉力和时间，发现别嘌呤醇从XO 中解离所需要的拉力值明显高于葛根素.同样的，别嘌呤醇从XO 中解离所需要的时间也明显高于葛根素.这说明相比葛根素，别嘌呤醇在解离过程中受到的阻碍更大，更不容易从XO 中解离，即XO 与别嘌呤醇之间的结合更加紧密，也可能是别嘌呤醇对XO 具有较强抑制效果的原因.
图6给出了别嘌呤醇在解离过程中所需外力随模拟时间的变化.为验证该曲线具有代表性，共进行了6次重复性实验，结果见图S1（A ）（见本文支持信息）.在0~700ps 时间内，别嘌呤醇所受的外力沿直线上升至700.54pN.外力达到最大值之后逐渐下降，直至920ps 时，外力出现小幅度的上升.
在Fig.5CAVER 3.0analysis of the shape and size of tunnel for XO
Table 1
Time and largest applied force of ligand dissociating from XO during the SMD simulations Inhibitor Allopurinol Puerarin Applied force/pN 635.25±48.61426.20±8.34Time taken to dissociate from active pocket/ps 2219±1971496±357
762
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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