1目的
规定纯化水微生物限度检查操作。
2适用范围
本文件适用于纯化水微生物限度检查操作。
3职责
微生物限度检查操作人员。
4微生物限度检查方法
纯化水采用薄膜过滤法进行检查。
滤膜孔径应不大于0.45μm，直径一般为50mm。
5内容
5.1设备
洁净工作台、恒温培养箱（30~35℃）、恒温水浴锅、电热干燥箱（250~300℃）、
高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。 5.2仪器及器皿
5.2.1薄膜过滤器、放大镜、显微镜。
5.2.2玻璃器皿：蓝盖试剂瓶（250ml）、培养皿（90mm）、吸管（l0ml分度0.l）、
载玻片、盖玻片。
玻璃器皿用前应洗涤干净无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约
2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或用牛皮纸包好。玻璃器皿，均于高压蒸
汽121℃灭菌30min，烘干备用。
5.3用具
5.3.1大、小橡皮胶头（放于干净带盖的容器中，并应定期用75%乙醇溶液浸泡）。
张君劢纯化水微生物限度检查标准操作规程
5.3.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可 用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
5.3.3酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、试管架、无菌滤杯、无菌滤膜、
打火机、记号笔、接种环、灭菌抹布等。
5.4消毒液
5.4.10.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
凝聚力工程5.4.275%乙醇溶液
5.4.33~5%来苏尔溶液
R2A琼脂培养基
5.5.1灭菌前后应对培养基的pH值进行校验。
5.5.2配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤灭菌后使用。5.5.3培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞
紧以免松动或脱落造成染菌。
5.5.4培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。
5.5.5灭菌后的培养基在2~8℃处保存备用，放置时间不能过长，以免水分散失及
染菌。已熔化的培养基应一次用完，开启后不宜再用。
5.5.6勿用电炉直接熔化琼脂培养基，以免营养成份因过度受热而破坏。应用水浴
或流通蒸汽加热。
5.6供试品抽样、保存及检验量
5.6.1抽样
按《纯化水抽样检验操作规程》进行抽样。
5.6.2取好的纯化水应及时送至微生物室检测。若不能及时检测，则需于2~8℃冷
电泳工艺藏保存，在8小时之内检测完毕。
5.6.3每次检验量为10ml。
5.7操作方法
5.7.1试验前准备
5.7.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、试管、吸管（10ml）、镊子、剪刀、无菌抹布、
菏泽地震纯化水微生物限度检查标准操作规程
消毒液等放在传递窗内，将最外层。每次试验所用物品必须事先计划，准备
足够用量，避免操作中出入操作间。
5.7.1.2开启洁净工作台紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min。
5.7.1.3操作人员在一更区更换工作鞋，然后用洗手液洗手，再用烘手器将双手烘干，
戴好一次性口罩；进入二更区更换无菌衣，戴好一次性无菌手套；进入缓冲
间，将双手放于消毒器下方，用75%酒精消毒双手；然后用手背按压门把手，
进入微生物限度检测室，按《人员进出检测室标准操作规程》进入微生物限
营销市场度检测室，关闭洁净工作台的紫外杀菌灯，用浸有消毒液的无菌抹布擦拭工
作台面，将传递窗内的试验用具去除牛皮纸后转移至工作台上，点燃酒精灯，
开始进行检测。
5.7.1.4每班次试验开始都要在工作台的左中右三处放置胰酪大豆胨琼脂培养基平皿，
检测沉降菌，直至试验结束后，同检测平皿一同培养。
5.7.1.5操作前先用酒精棉球擦手，再用酒精棉球擦拭供试品瓶的开口处周围。
5.7.2供试液的制备
以纯化水原液作为供试品
5.7.3试验步骤
5.7.3.1组装好薄膜过滤装置，装好无菌滤膜和无菌滤杯。
5.7.3.2打开纯化水样品瓶，用灭菌吸管吸取10ml纯化水，加入装好的滤杯中，过滤。5.7.3.3取下滤杯，用无菌镊子（每次使用前后于酒精灯上灼烧2~3s）取下滤膜，菌
面朝上贴于R2A琼脂培养基平皿上，注明样品编号。
5.7.3.4阴性对照：
方法同供试品检测，用100ml无菌水代替供试品取10ml过滤。
阴性对照应无菌生长。
5.7.4培养
将检测平皿倒置于30~35℃恒温培养箱中，培养≥5天。
5.7.5菌落计数
5.7.5.1一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以
暗背景，仔细观察。必要时用5~10倍放大镜观察，勿漏计细小的琼脂层内
纯化水微生物限度检查标准操作规程
和平皿边缘生长的菌落。
5.7.5.2若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落
计数；若平板生长有链状菌落，菌落间无明显界线，一条链作为一个菌落计，
但若链上出现性状与链状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓
延的较大的片状菌落或花斑样菌落，一般不宜作为计数用。
5.7.5.310ml结果报告时，以平皿上实际生长菌落数，报告菌数。
1ml结果报告时，以10ml计数结果除以10，向上取整数报告菌数；若生长
菌落数为0时，以＜1报告菌数。
5.7.5.4填写纯化水微生物限度检查记录，详见附录。
6结果判定
需氧菌总数≤100cfu/ml。激光快速成型机
7注意事项
7.1供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，不能接触可能
污染的任何器物，灭菌吸管不得用嘴吹吸。
7.2试验过程应在1h内完成，避免由于时间过长导致菌细胞繁殖或死亡。
7.3所用培养基应通过培养基适用性检查。
8相关文件
9附录
纯化水微生物限度检查记录。
纯化水微生物限度检查记录
供试品制备：打开纯化水样品瓶，分别吸取ml纯化水供试品，加入已安装好的过滤系统的滤杯中，过滤，取出滤膜，放入相应培养基中，培养，观察。
阴性对照：打开装有100ml无菌水的旋盖玻璃瓶，吸取ml无菌水，加入已安装好的过滤系统的滤杯中，过滤，取出滤膜，放入相应培养基中，培养，观察。
报告者/日期：复核者/日期：
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