封纪珍;李天洁;莫中福;李丽欣;王亚凡
【摘 要】目的:分析新生儿耳聋基因突变携带率,构建信息储备库,为临床诊断、遗传咨询提供可靠数据.方法:选取2014年1-10月在石家庄市妇幼保健院出生的6 945例新生儿于出生3d后采足跟血,应用荧光聚合酶链反应(PCR)法行先天性遗传性耳聋GJB2基因235delC位点、迟发性耳聋SL C26A4基因(IVS7-2A ＞G和2168A＞G)和药物性耳聋线粒体12S rRNA基因(1555A＞G和1494C＞T)检测,所有检测均在家属知情同意下进行.结果:6 945例新生儿中共发现突变携带者239例,检出率为3.44％.其中114例(1.64％)携带235delC杂合突变,1例(0.01％)携带235delC纯合突变;97例(1.40％)携带IVS7-2A＞G杂合突变,1例(0.01％)携带IVS7-2A＞G纯合突变,14例(0.20％)携带2168A＞G杂合突变;9例(0.13％)携带1555A＞G均质突变,2例(0.03％)携带1555A＞G异质突变,1例(0.01％)同时携带有IVS7-2A＞G杂合突变、1555A＞G异质突变和235delC杂合突变.结论:GJB2基因235delC位点和SL C26A4基因IVS7-2A＞G位点是新生儿耳聋基因突变的主要方式.新生儿耳聋基因检测工作的开展有助于了解新生儿耳聋基因携带情况,在分子水平上为优生优育工作提供一定的指导.
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
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【年(卷),期】2015(034)004
【总页数】4页(P293-295,301)
【关键词】遗传性疾病,先天性;婴儿,新生;听觉丧失;遗传筛查;聚合酶链反应;流行病学研究
【作 者】封纪珍;李天洁;莫中福;李丽欣;王亚凡
【作者单位】050081 石家庄市妇幼保健院;050081 石家庄市妇幼保健院;050081 石家庄市妇幼保健院;050081 石家庄市妇幼保健院;050081 石家庄市妇幼保健院
当药
【正文语种】中 文
遗传性耳聋是指由于基因和染体异常所致的耳聋。根据基因突变的位点和病情发生特点，遗传性耳聋又分为先天性耳聋、迟发性耳聋和药物性耳聋。随着我国新生儿听力筛查工作的广泛开展和临床经验的积累，医务人员发现并不是所有的听力损失均会在一出生即表现出来，甚至有一些新生儿通过了听力筛查之后出现了各种原因导致的迟发性听力损失。
2007年中国人民解放军总医院聋病分子诊断中心在国际上率先提出了在新生儿听力筛查中融入聋病易感基因筛查实施联合筛查的新理念与模式。联合筛查可使听力损失的高危因素发现率提高20倍［1］，北京［2］、新疆［3］、辽宁［4］等地陆续开展耳聋基因筛查。
本研究采用技术较为成熟、准确率高的荧光聚合酶链反应（PCR）法对石家庄市妇幼保健院（简称我院）2014年1—10月出生的6 945例新生儿，在家长知情同意的情况下为其行耳聋基因检测，并把检测结果进行总结分析，这是河北省石家庄市首次在新生儿人中进行的大规模耳聋基因突变筛查研究，探讨了河北省石家庄市新生儿耳聋基因突变携带率及发病情况，为研究石家庄市新生儿遗传性耳聋发生情况提供客观依据，为耳聋基因突变携带者的父母提供遗传咨询和再生育指导，建议将耳聋基因检测纳入临床诊疗常规。
1.1 研究对象选择2014年1—10月在我院出生的6 945例新生儿，其中男3 608例，女3 337例。
1.2 方法对新生儿进行听力筛查，告知家属并签署知情同意书后，采足跟血3滴于专用滤纸片上自然晾干，每个血斑直径不小于8 mm。所有新生儿均检测GJB2基因235delC位点、SLC26A4基因2位点（IVS7-2A＞G和2168A＞G）和线粒体12S rRNA基因2位点（1555A
＞G和1494C＞T）。
1.2.2
1.2.1 ①待滤纸片上血滴晾干后，用打孔钳打下3 mm血片放入1.5 mL无菌离心管中。②离心管中加入500 μL灭菌双蒸水，振荡混匀后静置5 min，12 000 r/min离心1 min。③吸弃上清，重复操作②1次。④吸弃上清，加入DNA提取液200 μL，100℃水浴8 min。⑤12 000 r/min离心5 min，上清为DNA扩增模板。应用济南英盛生物技术有限公司生产的先天性耳聋基因检测试剂盒、迟发性耳聋基因检测试剂盒和药物性耳聋基因检测试剂盒，每个反应孔加入23 μL相应检测位点反应液，2 μL上述DNA扩增模板，于ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：50℃2 min，1个循环；95℃2 min，1个循环；95℃10 s，61℃33 s，40个循环。
1.2.3 根据试验调节基线和阈值，Ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）＜35视为有效扩增，在此基础上观察实时荧光曲线判读结果：6-羧基荧光素（FAM）通道曲线呈“S”型增长判为野生型，6氯-6-甲基荧光素（HEX）通道曲线呈“S”型增长判为纯合突变型，2条曲线同时呈“S”型增长判为杂合突变型，2条曲线同时不增长视为无
效样本。
1.3 统计学方法应用Excel表统计并计算各突变位点携带率。
1.2.4
6 945例新生儿血片样本中共检出耳聋基因突变者239例，携带率为3.44%，其中GJB2基因235delC位点杂合或纯合突变115例（携带率为1.65%），SLC26A4基因杂合或纯合突变112例（携带率1.61%），线粒体12S rRNA基因均质或异质突变11例（携带率0.16%）。另有1例同时携带有IVS7-2A＞G杂合突变、1555A＞G异质突变和235delC杂合突变（携带率0.01%），见表1。
和为美本研究发现，携带有235delC位点杂合突变的新生儿中有1例右耳中耳炎伴有腭裂且未通过听力筛查；另有1例新生儿虽通过了听力筛查，但其父母均为先天性耳聋患者。1例携带有235delC位点纯合突变的新生儿和1例同时携带有IVS7-2A＞G杂合突变、1555A＞G异质突变和235delC杂合突变的新生儿都通过了听力筛查，并于6个月龄回访时听力正常。1例携带有IVS7-2A＞G纯合突变的新生儿未通过听力筛查，于3个月龄时进行听力诊断，CT结果示右耳前庭水管扩张，耳蜗发育不全。
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遗传性耳聋是临床上最常见的疾病之一，2006年我国第二次残疾人抽样调查数据显示，中国听力残疾患者为2 780万，其中单纯听力残疾达2004万，听力残疾现患率约为2.11%；7岁以下聋儿约为74万，并以每年2～3万人的速度在增长［5］。耳聋基因检测可将遗传性耳聋确诊的时间提前到出生后2周，也可对曾有耳聋患儿生育史的夫妇做产前诊断，还可以对迟发性和药物性耳聋基因携带者给予生活和用药指导，因此耳聋基因检测显得越来越重要。
光学学报3.1 GJB2基因的致病特点及相关病例分析GJB2基因编码的连接蛋白，主要参与细胞间信号介导和离子的传递［6］，其异常会影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子的回收而致聋，属于先天性耳聋常见的致病基因，在中国人中26%～33%的语前聋患儿为GJB2基因突变所致，占常染体隐性遗传耳聋的28%，235delC是该位点主要的突变方式，检出率约为13.6%～21.5%［7］。我院6 945例新生儿人中GJB2基因235delC位点杂合突变携带者114例，其中有1例携带者的父母均为先天性耳聋患者，但该新生儿通过了听力筛查，考虑可能是该新生儿只遗传了父方或母方的一个致病突变，形成235delC杂合突变，是隐性基因携带者而未发病；也可能是存在其他未被检测到的突变位点形成复合杂合状态，不排除迟发性耳聋的发生。另有1例携带者右耳中耳炎伴有腭裂且未通过听力筛查，其
父母听力正常，考虑其原因应是在其他区域还存在基因突变与235delC位点形成复合杂合突变致聋，这2例新生儿均应进行GJB2全序列分析以明确病因。本研究还发现1例235delC纯合型突变者通过了听力筛查，于该新生儿6个月龄时回访其双耳听力正常，以后仍会紧密关注其听力变化情况。据研究报道，有50%以上的极重度耳聋患者在3个月龄时具有正常的听觉行为，至少20%在6个月时仍具有听觉行为［8］。因此，上述3种特殊病例均需每3个月进行一次回访，追踪其听力变化情况以免延误和干预。
3.2 SLC26A4基因的致病特点及相关病例分析SLC26A4基因突变是大前庭水管综合征的主要致病基因，其编码的彭德莱（Pendred）蛋白主要由疏水性氨基酸组成，其功能主要参与碘/氯离子的转运［9］。在内耳中，Pendred蛋白表达于内淋巴管和内淋巴囊上皮细胞及椭圆囊和球囊边缘的神经细胞中［10］。该蛋白的异常可影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递而导致听力损失，患者常因颅内压增高后受外力而聋，故又名一巴掌致聋基因，是仅次于GJB2基因突变而引起感音神经性耳聋的遗传学病因［11］，也是导致迟发性耳聋的重要原因。在中国大陆，大前庭水管综合征患者SLC26A4基因的突变率高达97.9%，IVS7-2A＞G是该位点主要的突变方式［12］。我院6 945例新生儿人中SLC26A4基因携带者98例，其中发现1例IVS7-2A＞G纯合突变患者，双耳均未通过听力筛
qltv查，召回其父母采血行耳聋基因检测，结果显示均为IVS7-2A＞G杂合突变携带者，验证了该基因遵循的是常染体隐性遗传方式。该患儿于出生后3个月龄时行听力诊断，CT结果示其右耳前庭水管扩张，耳蜗发育不全。建议择时安装人工耳蜗或佩戴助听器，同时，该夫妇再次生育时应行产前诊断。由于该基因的不同突变均与前庭水管扩张有直接关系［13］，单纯IVS7-2A＞G杂合突变也有导致中度学语后和重度学语前耳聋的报道［14］。因此认为检测出的IVS7-2A＞G和2168A＞G杂合突变携带者均应行SLC26A4基因全序列分析以排除复合杂合的可能，进一步明确病因。无论携带单杂合突变还是复合杂合突变的新生儿在成长过程中均应避免头部外伤、不用力憋气、擤鼻或咳嗽、远离噪声，一旦发现听力变化要及时就诊。
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