刚度矩阵人类基因组计划(humangenome projec t, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出,于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。
序列图的绘制主要采用两大策略: 即逐个克隆法(Cloneby Clone)和全基因组鸟法(WholeGenome Shot-gun)。 逐个克隆法的原理
dx4
逐个克隆法的原理是Sanger双末端终止法。人类基因组框架图全部采用基于Sa nger双脱氧原理的自动化毛细管测序。在1977年,英国人Fre deric k Sanger创建了双脱氧链末端合成终止法(chaintermin ation method),简称Sang er法、双脱氧法或酶法。他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP,就会产生一系列末端终止的DNA链,并能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddN TP决定的。
Sanger双末端终止法的基本原理是利用D NA聚合酶,以待测单链D NA为模板,以dNTP为底物,设立四种相互独立的测序反应体系,在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸(dideox yribo nucl e oside tripho sphat e,ddNTP)作为链延伸终止剂。具体实验是通过PCR来完成的,但与普通PC R不同,它只需要一个引物而不是一对。在4个相同的反应体系中分别加入普通的dNT P以及4种不同的dd NTP(比如体系1里面缺少dA TP,而有ddAT P,以此类推)。假设四个体系中分别加入的是ddA TP, ddGTP, ddCTP和ddGTP我们就分别把这个叫做A,G,C,T体系,然后每个体系中,会在遇到相应碱基的时候停止反应,这样就产生了一系列长度不一并且分别在以A,G,C,T时终止的D NA片段,比如A体系中的DNA片段,都是以A结尾的DNA。通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,放射自显影检测后,从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列,由此推知待测模板链的序列。男子戒毒所被打致死
逐个克隆法基本步骤
逐个克隆法的基本步骤是:物理图谱的构建→BAC克隆的筛选→“工作框架图”的构建→序列的全组装与“完成图”构建。 物理图谱的构建的基本步骤如下:确定各STS序列及其在基因组中的位置→大插入片段基因组文库的构建(BAC文库)→以特定STS为标记筛选并定位克隆→含有STS的克隆在基因组中排序。
BAC克隆的筛选的基本步骤如下:用N otI、S acI等处理基因组,通过脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DN A→纯化后与载体连接,得到插有外源DN A片段的BAC载体→通过电转化将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞,在含有抗生素的筛选培养基中筛选带有相同外源DNA片段的单克隆菌落→“STS-
PCR反应池”方案筛选种子克隆→相互间具有重叠片段的B A C克隆根据STS信息组装成c ontig,并定位于基因组上。
值得注意的是,STS的密度尚未达到绘制高精度物理图谱的要求,且在基因组中的分布不均匀,造成很多区域没有阳性克隆覆盖,形成空洞。因此需用指纹图谱(FPC法)或末端序列(W alkin g by End Sequen ce)步移等手段对种子克隆进行延伸,形成连续克隆。利用延伸方法筛选得到的克隆称为延伸克隆。
“工作框架图”的构建:根据序列与S TS databa se进行b lastn比较结果,将克隆定位末端序的比较,判定延伸在c ontig外的一端序列。并可及时进行w alking,筛选新的克隆。
鸟法
鸟法或霰弹法是一个高度计算机化的方法,它是先把基因组随机分成已知长度(2000个碱基对、1万个碱基对、5万个碱基对)的片段,然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的大段并确定它们在基因组上的正确位置。ezproxy
人类基因组计划中塞莱拉公司的科学家先用霰弹法测序DN A,并将整个基因组覆盖8
次,然后用两个数学公式将人类基因组序列多次组装起来,确定出了基因中的转录单元,预测出60%
钝化处理的已识别基因的分子功能。最后研究人员将人类基因组信息与此前已完成的果蝇和线虫的基因组序列进行比较,从而出了三者共有的核心功能。
45号钢鸟法的工作流程图:
两种方法对比表