浙江科技学院学报，第18卷第3期,2006年9月Jo urna l of Zhejiang U nive rsity of Science and T echnology Vo l.18No.3,Sep.2006
收稿日期:2006-06-02
作者简介：魏培莲(1976— )，女，山东邹城人，讲师，博士研究生，主要从事微生物固态发酵方面的研究。 抗生素的固态发酵研究进展
魏培莲
1,2
，徐 晖1，岑沛霖
2
(1.浙江科技学院生物与化学工程学院，杭州310023;2.浙江大学生物化工研究所，杭州310027)
摘 要：固态发酵与液态深层发酵相比有自己的优点和缺陷。近十几年由于能源紧张和环境问题日益突
出，固态发酵重新受到人们的重视。在回顾近年来国内外抗生素的固态发酵研究情况的基础上，重点对环孢菌素A 、依枯草菌素、头孢菌素C 、土霉素、四环素、头霉素C 、青霉素等的研究现状进行了综述。关键词：固态发酵；抗生素；研究进展 中图分类号:T Q927;R978.1 文献标识码:A 文章编号:1671-8798(2006)03-0171-06
Review of Solid State Fermentation for Antibiotic Production
WEI Pei -lian
1,2
,XU Hui 1,CEN Pei -lin
2
(1.School of B iological and Chemical Engineering ,Zhejiang U niversity of Science and Technolog y ,Hangzhou 310023,China ;
2.Research Institute o f Bio -Chemical Eng ineering ,Zhejiang U nive rsity ,H ang zhou 310027,China )
A bstract :Co mparing w ith submerged fermentation ,solid state fermentation (SSF )has its ow n merits and limitatio ns.Since the emergence of energy and environm ental problems became
mo re and mo re pro minent during last decade ,SSF reg ain its recog nitions.We review ed the devel -o pments of SSF fo r antibio tic productio n ,m ainly o n the productio n of cy clo sporine A ,iturin ,cephalospo rin C ,o xy tetracycline ,tetracy cline ,cephamy cin C and penicillin.
Key words :solid state fermenta tion (SFF );antibiotic ;review
固态发酵(So lid State Fermentation ,SSF )是指在几乎不存在游离水的条件下微生物利用天然物质作为碳源和能源的发酵工艺。它是人类利用微生
物生产产品历史最悠久的技术之一，在我国最早可以追溯到公元前3000年，但后来由于液态深层发酵的大规模发展和固态发酵本身所存在的一些缺陷，使得固态发酵在很长一段时间内没有得到应有的重视和发展。近十几年来，由于能源危机与环境问题的日益突出，固态发酵技术再次引起人们的兴趣，固 态发酵领域的研究也有长足的进步,20世纪90年代以来，大约有上千篇论文在国内外的期刊上发表。目前，固态发酵在很多领域都有研究和应用，主
动平衡试验
要有：抗生素和生物活性物质、酶制剂、有机酸及其他一些具有重要应用价值的产物和有机肥料。抗生素作为微生物的一种次级代谢产物，它在微生物生长的稳定期开始形成，早期的一些研究已经表明通过常规的液态发酵方法产量较低的抗生素，通过SSF 往往可以获得较好的效果。近年来，随着固态
发酵技术在各研究领域的进步，抗生素的固态发酵也有了很大的变化。抗生素的种类覆盖了青霉素(Penicillin)、头孢菌素(Cephalosporin)、四环素(Tetracy cline)、氯四环素(金霉素)(Chlo rotetracy-cline)、土霉素(Oxy tetracy cline)、依枯草菌素(Iturin)、表面菌素(Surfcatin)、紫放线菌素(Acti-no rhodin)、甲基依诺霉素(M ethy lenomy cin)、单根菌素(M onorden)等(详见表1)。这些研究主要集中在国外，国内对抗生素的固态发酵研究较少，几乎没有什么进展。本文较为详细地综述了国内外抗生素的固态发酵研究情况，以期对国内抗生素的固态发酵研究提供一些有益的参考。
表1 利用固态发酵技术生产的抗生素种类产物名称微生物名称可用底物Penicillin
(青霉素)
Penici llium chry s ogenum甘蔗渣Cephalospo rin
(头孢菌素)
Cepharosporium armo nium大麦
Cephamy cin (头霉素C)Streptomyces clav uligerus
麦麸+棉籽饼
+葵花籽饼
Tetracycline
中国现代医学杂志(四环素)
Streptomyces viridi f aciens番薯渣
O xytetracycline
(土霉素)
Streptomyces rimosus玉米芯
I turin
江西省禁毒条例
(依枯草菌素)
Bacillus subtilis麸皮
A ctinorhodin
(紫放线菌素)
Streptomyces coelicolor凝胶培养基Surfactin
(表面菌素)
Bacillus subtilis大豆渣
M onorden
(单根菌素)
H wmicola f uscoatra凝胶培养基
1 固态发酵与液态深层发酵的优缺点固态发酵和液态深层发酵是两种完全不同的发酵方式，目前液态深层发酵技术发展已比较成熟，但由于设备的投入大、技术要求高，从而限制了其在某些领域的应用。而且，对于抗生素等微生物次级代谢产物的生产而言，由于发酵周期较长，在发酵后期菌体自溶
等因素的影响，产物的产量往往很难提高，而固态发酵正可以在这个方面弥补液态深层发酵的不足。固态发酵的研究虽然没有液态深层发酵成熟，但不可否认，固态发酵与液态发酵相比，在以下方面仍具有明显优势：固态发酵的设备简单、投资少、操作方便；固态发酵的原料来源十分广泛、价格十分低廉，农作物秸杆、城市生活垃圾、淀粉质原料、食品工业下脚料及动物排泄物等都可以用于固态发酵；固态发酵可以生产的产品种类多、用途广，既可以是具有较高价值的酶制剂、有机酸及抗生素等，又能够用于单细胞蛋白及有机肥料等的生产；固态发酵的目标产物在单位体积生物反应器中的产率往往比液体深层发酵高；固态发酵既可以用于纯种发酵，又可以利用混合菌种或生态系统中自然存在的微生物发酵，当多种微生物共存时，可以充分利用它们之间的相互作用，达到更好的效果；由于目的产物蓄积在固体基质表面，而且许多固态发酵产物不需提取可以直接使用，因而大大减少了溶剂的使用量。当然，固态发酵也具有一些较难克服的缺点：固态发酵的劳动强度比较大，生产效率较低；固态发酵中原料灭菌和发酵过程控制比较困难；固态发酵每批产品的质量也会有很大差别。总之，固态发酵既有一定的优势，也有其本身的缺陷，对于不同的发酵过程，固态发酵和液态深层发酵发挥着不同的作用。对于抗生素的生产而言，抗生素是微生物的次生代谢产物，多在菌体生长的后期才开始大量形成，而且许多抗生素都是微生物的胞内产物，这些特点决定了固态发酵在抗生素生产中具有较大的优势。
2 国内外抗生素固态发酵研究概况
2.1 环孢菌素A的固态发酵
环孢菌素A是一种由11个氨基酸组成的环状肽，最初是用作抗真菌肽，后来发现这种抗生素具有抗真菌、抗寄生虫、抗感染和免疫抑制的作用，故成功地应用于心脏、肝脏和肾脏移植病人中,1994年销售量就已超过了10亿美元。目前，环孢菌素主要采用液态发酵的方法来生产，也可通过化学合成的方法来生产，但都比固态发酵要复杂得多。由于化学合成的复杂性，人们的注意力已转移到利用固态发酵的方法来提高其产量。Ramana M urthy等[1]利用Toly poclad ium in f latum的一个高产突变株，研究了固态发酵生产环孢菌素A的方法。当菌株用湿润的麸皮发酵时1kg麸皮可产生310～459 m g环孢菌素。通过不同的诱变处理方法,T.in-f latum A TCC34921的产量由当初的1kg麸皮459 m g提高到了(1031±27)mg，是液态发酵中利用小麦粉发酵的2倍[2]。编号为T.inf latum DRCC 106的诱变菌株，在最适的发酵条件下，产量为1kg 麸皮4843m g。最适发酵条件如下：以麸皮作为主
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要基质，其中含有粟米粉(质量分数，下同)20%，高粱粉10%，硫酸锌0.15%，氯化铁0.25%，氯化亚钴0.05%，初始含水量为70%，接种量60%(按湿重计)，培养温度25℃，初始pH值2.0，培养时间10d。发酵后用溶剂提取，然后用柱层析法分离，所得产品符合美国药典要求。
C.Sekar等[3]研究了以Toly pocladium sp.利用麸皮作为固态基质生产环孢菌素A的情况。结果发现用H
Cl水解麸皮可提高环孢菌素A的产量，其产量是液态深层发酵的10倍。为了进一步提高固态发酵中环孢菌素A的产量,C.Sekar和K. Balaraman[4]研究了浅盘穿孔、基质厚度、接种方式和基质相对湿度对Toly pocladium sp.环孢菌素A 产量的影响。结果表明，浅盘穿孔对环孢菌素A产量的影响不大，而其他条件的优化均有利于进一步提高固态发酵中环孢菌素A的产量。在优化的发酵条件下环孢菌素A有望大量生产。
2.2 头孢菌素C的固态发酵
早在1984年，的W ang H H等[5]就研究了利用大米来生产头孢菌素C。他们对发酵条件进行了较为细致的研究，得到的条件如下：以大米作为主要基质，其中含有0.65%(质量分数)的蛋白胨,0.65%的硫酸铵,0.26%的肌醇,1.3%(体积质量比)的微量元素溶液,0.65%的碳酸钙,0.65%的硫酸钙,0.065%的硫酸钾,1.3%的蔗糖,0.13%的DL-蛋氨酸和2.6%的甲基油酸盐。初始含水量为49%～51%，水活度是0.985，发酵温度25℃，发酵时间7d，产量达到6.42mg/g。
Jermini M F和Demain A L[6]研究了S trepto-myces clavuligerus和Cephalosporium acremonium 固态发酵产头孢菌素的条件。S.clav uligerus NR-RL3585用大麦发酵7d产量达到300mg/g基质, C.acremonium发酵10d产量达到950m g/g。
K.Adinarayana等[7]对用Acremonium chry-sogenum A TCC48272固态发酵生产头孢菌素C的条件进
行了优化。他们对不同的基质原料进行了选择，在麸皮、Wheat rawa、Bombay rawa、大麦和米糠中,Wheat raw a最适合头孢菌素的生产。以Wheat rawa为主要基质，对其他条件进行优化如下:Wheat rawa加入1%(质量分数)的可溶性淀粉,1%(质量分数)的酵母提取物，培养温度30℃，营养盐按1.5∶10 (体积质量比)的比例加入，接种量10%(体积质量比)，初始含水量为80%，初始pH值6.5。在此条件下，头孢菌素C的产量达到22.281mg/g。
2.3 依枯草菌素的固态发酵
依枯草菌素是枯草芽孢杆菌产生的一种抗真菌抗生素，大田实验已证明其可有效抑制植物病原菌，其结构是一个环状七肽
R是β氨基酸的脂肪酸侧链。Ohno等[8,9]对利用黄豆饼粉固态发酵生产依枯草菌素的可行性进行了研究。研究表明，与液态深层发酵相比，固态发酵整体来讲具有优越性。在固态发酵中,15g,100～500g和3kg的培养规模中，依枯草菌素的产量(1g 湿基质的含量)分别达到了1.0～1.65m g,0.5～1.0m g和0.55～0.8mg，而在5L的液态发酵罐中产量为0.032～0.044mg。Ohno等同时发现，在固态发酵中，可以选择性地生产依枯草菌素的有效成分，其对植物病原体的抑制作用更强。他们[10]还对另外一株枯草杆菌Bacillus subtilis RB14固态发酵同时生产依枯草菌素A和表面菌素进行了研究，结果发现，尽管两者由同一个基因tpa-14编码，但依枯草菌素A的最适产生温度是25℃，而表面菌素的最适产生温
度是37℃。他们还对温度对依枯草菌素A的5种同系物的相对比例的影响情况进行了研究，发现只有含β-氨基酸残基的一般长度的脂肪链的同系物才受影响，脂肪链稍长的同系物(C16)随着温度的升高，其比例增加。
固态发酵中,2d后依枯草菌素达到最大产量，而在液态发酵中是在第五天达到最大产量，而且固态发酵中的产量是液态发酵的6～8倍[2,11]。Ohno 等[11]也证实，固态发酵中，依枯草菌素的提取更简单，所用溶剂也更少。M akkar和Comeotra[12]报道说利用工业废物生产依枯草菌素比利用合成培养基菌株的生产速率更快，产物的合成更多。在印度，糖蜜是用于固态发酵生产枯草菌素的主要基质，因为糖蜜不仅含有丰富的糖和其他必需的营养成分，而且价格低廉。
2.4 头霉素C的固态发酵
头霉素C是一种广谱的β-内酰氨类的抗生素，可由多种微生物产生，如Nocardia lactam durans, S trep tom yces catteya和S.clauverigerus。因液态深层发酵需要消耗较多的能量，人们开始研究利用固态发酵的方法来生产头霉素C。Krishna Prasad
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第3期魏培莲，等：抗生素的固态发酵研究进展
Kota和Padm a Sridhar[13,14]对利用麸皮固态发酵生产头霉素C进行了研究。固态发酵条件为：麸皮5g，棉籽脱脂饼粉5g，葵花籽饼粉5g，玉米浆1g, MgSO47H2O0.06g,CaCO30.1g,K2HPO44.4g，基质初始含水量为80%，初始pH值为6.5，发酵温度在28～30℃，发酵周期约5d。S treptomy ces clav uligerus的生长在第2天看到，从第3天开始生成大量菌丝，到第5天时菌丝量达到稳定。头霉素C在第3天开始生成，在第5天的时候则以15mg/g 基质的最大速率生成，直到第30天都基本保持稳定。研究表明，固态发酵所生产的头霉素C比液态发酵方法所产具有更好的稳定性,Balkrishnan和Pandey[2]的研究结果与此类似。固态发酵中头霉素C产生的最佳温度和pH都与液态发酵中是一致的，但是在固态发酵中很难维持恒定的温度和pH值。
2.5 四环素的固态发酵
Yang和Ling[15]对利用生绿链霉菌以红薯渣为基质固态发酵生产四环素进行了研究。结果发现在红薯废渣上进行四环素的固态发酵，四环素在第3天开始形成，在第5～6天达到高峰。而在液态发酵中，随着发酵时间的延长，菌体发生自溶，四环素的产量下降。生绿链霉菌用红薯渣固体发酵生产四环素的最佳条件是：红薯渣的初始含水量(质量分数，下同)控制在68%～72%,pH控制在5.8～6.0，补充(NH4)2SO40.5%,CaCO31.8%,NaCl0.6%, KH2PO40.4%,M gCl20.8%，甲硫氨酸0.2%，谷氨酸钠0.4%。在26℃培养5d,1g干基质产生四环素2129μg。以花生粉作氮源生产四环素的最佳条件为：红薯渣补充花生粉(质量分数，下同)20%, (NH4)2SO40.5%,CaCO31.8%,NaCl0.6%, KH2PO40.4%,M gCl
n 二甲基亚硝胺
20.8%，可溶性淀粉10%，甲硫氨酸0.2%，组氨酸0.8%，谷氨酸钠1.6%。这种情况下,1g基质四环素产量高达4720μg。固态发酵虽达不到液体深层发酵的水平，但从利用农业废物、节约能源的角度讲，作为饲料添加剂的生产方法还是可行的，值得进一步研究应用和推广。
2.6 土霉素的固态发酵
YANG S.S.和W.J.Sw ei[16]对Strep f omy ce srimosus TM-55用玉米芯作为固态底物发酵生产土霉素进行了研究。发现土霉素在第4天开始产生，第8天达到最大。适合土霉素固态发酵的最佳条件为：初始pH5.2～6.3，初始含水量(质量分数，下同)为64%～67%，玉米芯中添加20%(质量分数)米糠,1.5%～2.5%的(NH4)2SO4,1.0%的CaCO3,2%的MgSO47H2O,0.5%的KH2PO4,0.6%～0.8%的天冬氨酸或赖氨酸，在25℃到30℃培养8d。1g 基质可以产生7～8mg土霉素。在液态发酵中，也发现土霉素的产量由于菌体自溶而下降的现象，而在固态发酵条件下土霉素的产量较稳定。另外, Yang S.S.,Yuan S.S.[17]还对S trep fom yce sri-mosus TM-55用红薯渣作固态基质发酵生产土霉素的情况进行了研究。结果发现土霉素在第3天开始检测到，第6天达到高锋，一直到第12天都保持稳定。土霉素发酵的最佳条件为：初始pH5.5～6.5，添加20%(质量分数)的脱脂花生饼粉作为唯一氮源,1.0%(质量分数)CaCO3,2.0%(质量分数) M gSO47H2O,26～35℃培养6～7d，土霉素的产量达到12.1mg/g基质。Yang和Wang[18]发现在固态发酵中菌丝体和菌丝片断越大抗生素的产量越高，这一特点为判断抗生素的活性提供了一个良好的指标。
2.7 青霉素的固态发酵
青霉素的固态发酵由于其产量较高曾经在一段时间受到广泛关注，后来随着液态深层发酵水平的提高逐渐被忽视。Barrios-Go nzalez等[19]证实了怎样在短时间内用固态发酵方法大量地生产青霉素。在液态发酵条件下，报道的最大产量为9.8mg/L，而在固态发酵条件下，产量为13mg/g，这证实了固态发酵的经济性和可行性。
J.Barrios-G onzález等[20]研究了用营养液浸泡甘蔗渣在非无菌条件下固态发酵产青霉素的情况。结果显示，这种方法可大大提高青霉素的产量，提高初始含水量到70%有利于青霉素的产生(以后的研究[21]发现甘蔗渣、营养物质、水三者的比例不同对青霉素的产量影响较大)，与液态发酵的比较显示出一定的优越性。在甘蔗渣作支持物固态发酵生产青霉素的研究中，用较大颗粒(14m m)的甘蔗渣可使青霉素的产量提高37%，但这一影响是归因于蔗渣中较高的糖含量。提高填充密度青霉素的产量可提高20%，如果通气带走的水分能及时补充，通气不会对青霉素的产量产生较大的影响[22]。
2.8 其他抗生素的固态发酵
2.8.1 利福霉素B G.Venkatesw arlu等[23]对Amy colatopsis mediterranei VA18菌株固态发酵和液态发酵生产利福霉素B进行了比较研究。在液态发酵过程中，摇瓶发酵的时间为7d，产量为1.8g/L,
174浙江科技学院学报第18卷
2L发酵罐的发酵时间为6d，产量为2.45g/L。固态发酵的最适条件为：初始pH值7.2，接种量30%, 32℃培养9d。基质的初始含水量对利福霉素B的产量影响较大，当含水量为70%(质量分数)时产量为26g/kg，含水量为80%时，产量为32.8g/kg，当含水量为90%时，基质状态接近浆状，产量最高，达到39g/kg，是液态发酵罐培养的约16倍。摩托罗拉l2
2.8.2 新霉素 K.A dina ray ana等[24]用S trepto-myces marinensis N UV-5固态发酵来生产新霉素，研究了营养添加物对新霉素产生的影响。结果表明：糊精、悬钩子种子粉和浓缩营养盐对新霉素的产生影响较大，最佳培养基是1kg麸皮含有14.1g 糊精、64.91g悬钩子种子粉和172.6m L浓缩营养盐，在此培养基中新霉素的最大产量达到17150 mg/kg麸皮。
2.8.3 表面菌素 该物质发现于1968年，其结构与伊枯草菌素类似，同样是7个氨基酸组成的环状肽。它的命名是因为它具有表面活性剂的活性，是目前已知的最强的生物表面活性剂。它也被用作血纤维蛋白凝结的抑制剂，还可以溶解红血球以及一些细菌的原生质体或原生质球。表面菌素的表面活性和它的抗生素活性意味着其市场需求量较大。表面菌素的生产主要是通过芽孢杆菌的深层发酵，其所需要的培养基虽然相对简单，但也比较昂贵，而且芽孢杆菌的液态发酵产物中表面菌素的含量较低，因此，人们开始研究利用固态发酵的方法来提高表面菌素的产量[25-27]。世界范围内对表面菌素的需求量极大，如果固态发酵方法可以达到较高的产量，并且可进行大规模的生产，则其前景是非常诱人的。2.8.4 单根菌素 它是一种具有多种生物活性的真菌代谢产物。单根菌素具有抗真菌活性，
它可以导致孢子和芽管的不正常吸水，从而使孢子不能够萌发或细胞膨胀破裂；单根菌素对p60v-arc蛋白激酶具有特异性抑制作用；此外，单根菌素具有抑制植物种子种皮形成活性、调节植物生长活性，还可通过控制和刺激排卵作用提高动物的生育能力。Lam K.S.等[28]研究了空间飞行效应对H um icola f us-coatra WC5157菌株在固态发酵中生产单根菌素的影响，结果表明，空间飞行可提高H.f uscoatra WC5157菌株单根菌素的产量，最高产量提高近3倍。
2.8.5 洛伐他汀(lovastatin) 又名Mo nacolin K，是人体胆固醇生物合成的关键酶H MG-CoA还原酶的竞争性抑制剂，可有效降低人体内有害胆固醇LDL的水平，从而减少冠心病的发生。目前洛伐他汀的生产根据菌种不同主要有两种不同的生产方式。生产菌种如果是红曲霉，一般是采用固体发酵的方法进行，如果是土曲霉，则主要采用液体发酵的方法进行。红曲霉固态发酵产洛伐他汀的研究较多[29,30]，这里不再详述。目前，笔者对土曲霉固态发酵产洛伐他汀的情况进行了初步研究，以麸皮或大米为主要基质，产量达到约2000～3000μg/g干基质，有一定的研究价值。
3 抗生素固态发酵存在的主要问题及发展前景
目前，随着世界范围内环境和资源问题的日益突出，抗生素的固态发酵引起了国内外研究者的广泛关注，但由于长期以来固态发酵的研究力度不够，研究水平普遍偏低，抗生素的固态发酵还存在许多问题，主要表现在以下几个方面:
第一，能够进行固态发酵的抗生素种类偏少。如前所述，虽然目前已对多种抗生素的固态发酵进行了研究，但相对实际生产和应用的抗生素种类而言，则是很小的一部分。
第二，缺少比较成熟的大规模生产生物反应器，包括大量固体底物的经济有效的机械化装卸、混合、蒸煮、灭菌、接种和培养的设备装置，这无疑较大程度上限制了抗生素固态发酵在实际生产中的应用。
第三，缺少固态发酵过程中参数检测、发酵调控和自动化控制的仪表，使得发酵参数的控制非常困难，整个发酵过程不容易控制，产品质量难以保证。同时，由于发酵参数的检测困难，使得很难建立能够对数据作有效预测和最佳化的数学模型，这反过来又限制了生物反应器的设计发展和发酵过程的有效调控。
襄樊电影
在人们与微生物的持续斗争过程中，抗生素的需求量非常巨大，利用固态发酵的方法不仅能够增加目前市场上抗生素的供给，还有可能生产出更多种类、更廉价的抗生素，尤其是在农用、兽用抗生素的生产方面更有广阔的前景。农用、兽用抗生素对产品的纯度要求不如医用抗生素高，利用固态发酵法生产农用、兽用抗生素，则可以提高抗生素得率，降低成本，这将为农用、兽用抗生素的大规模生产和广泛应用提供新的途径。而且，固态发酵主要是以一些农作物和粮食加工的副产物作为原料，发酵以后产物不需要提取，可以直接添加到饲料中使用，与
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第3期魏培莲，等：抗生素的固态发酵研究进展
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