监曲粕航元Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月・2439・HPLC法测定联苯节瞠乳膏中8种抑菌剂和1种抗氧剂 唐立超，郑淑凤，顾立强，黄剑英，李玲玲
厦门市食品药品质量检验研究院，福建厦门361012
摘要：目的建立同时测定联苯节哇乳膏中8种抑菌剂和1种抗氧剂含量的方法。方法釆用CAPCELL PAK ADME谱柱，以0.02mol/L乙酸鞍溶液-甲醇为流动相，梯度洗脱，体积流量为1.0mL/min，柱温为30°C，检测波长为218nm.进行专属性、线性关系、检测限与定量限、精密度、回收率、稳定性等方法学考察。检测来自13家生产企业、共37批次联苯节哇乳膏中抑菌剂山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎澳镀和抗氧剂二丁基径基甲苯（BHT）的含量。结果抑菌剂山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠钱和抗氧剂BHT的线性范围分别为9.924〜198.5、10.43〜208.6、24.94〜498.7、10.07〜201.5、10.13〜202.6、10.13〜202.5、10.03〜200.5、4.053〜81.04、10.10〜202.0pg/mL（r为0.9993—1.0000）：平均回收率为9&6%〜100.9%（RSD为0.52%〜1.43%）。专属性、检测限与定量限、精密度、稳定性等方法学考察均符合要求。各批次苯节哇乳膏均未检出苯甲酸、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯，检出山梨酸、苯甲醇、尼泊金乙酯、苯扎漠钱和BHT。结论建立的方法操作简便、结果准确，可用于联苯节瞠乳膏中抑菌剂和抗氧剂含量的同时测定。 关键词：高效液相谱法；联苯节醴乳膏；抑菌剂；抗氧剂；含量测定
中图分类号：R927.2文献标志码：A文章编号：1674-6376（2020）12-2439-05
DOI:10.7501/j.issn.1674-6376.2020.12.015
Determination of eight bacteriostats and one antioxygen in Bifonazole Cream by HPLC
TANG Lichao,ZHENG Shufeng,GU Liqiang,HUANG Jianying,LI Lingling
Xiamen Institution for Food and Drug Quality Control,Xiamen361012,China
Abstract:Objective To establish a method for simultaneous determination of eight bacteriostats and one antioxygen in Bifonazole Cream.Methods The determination was performed on CAPCELL PAK ADME column with mobile phase consisted of0.02mol/L ammonium acetate solution-methanol in gradient elution at a flow rate of1.0mL/min.The column temperature was30°C,and detection wavelength was set at218nm.The specificity,linear relationship,limit of detection and limit of quantitation,precision, recovery,stability were investigated.The contents of sorbic acid,benzoic acid,benzyl alcohol,methyl paraben,ethyl paraben,propyl paraben,butyl paraben,benzalkonium bromide and antioxidant dibutyl hydroxytoluene(BHT)in37batches of Bifonazole Cream from13manuf
acturers were determined.Results The linear range of bacteriostats sorbic acid,benzoic acid,benzyl alcohol, methylparaben,ethylparaben,propylparaben,butylparaben,benzalkonium bromide and antioxygen BHT were9.924一19&5,10.43—208.6,24.94—498.7,10.07—201.5,10.13—202.6,10.13—202.5,10.03—200.5,4.053—81.04,10.10—202.0^ig/mL(r=0.9993—1.0000)respectively.The average recoveries were98.6%一100.9%with the RSDs of0.52%—1.43%.The specificity,limit of detection and limit of quantification,precision,stability and other methodological investigation met the requirements.Benzoic acid, methyl paraben,propyl paraben and butyl paraben were not detected in all batches of benzimidazole cream,but sorbic acid,benzyl alcohol,ethyl Paraben,benzalkonium bromide and BHT were detected.Conclusions The method is simple and accurate,and can be used for simultaneous determination of bacteriostats and antioxygen in Bifonazole Cream.
Key words:HPLC;Bifonazole Cream;bacteriostats;antioxygen;contentdetermination
联苯节哇（白霉醴,bifonazole）是一种咪哇类广谱抗真菌药，对白念珠菌、皮肤癣菌及酵母菌等具有较强的抗菌活性，适用于浅表皮肤真菌感染山〕。联苯节哇乳膏收载于《中国药典》2015年版（二部）⑷，但其现行标准尚未对其中的抑菌剂和抗氧剂含量作出规定。由于乳膏中的抑菌剂和抗
收稿日期：2020-02-18
第一作者：唐立超，硕士，主管药师，从事药品检验工作。Tel:（0592）5619836E-mail:tangchong100@163
・2440•缶必；丰侍珂总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月
氧剂均对人体有一定毒性，用量过多可能危害人体健康，导致患者出现皮肤刺激或过敏，尼泊金酯类抑菌剂过量使用还可能增加乳腺癌风险而抑菌剂和抗氧剂用量不足，又可能导致乳膏霉变、酸败、氧化，给患者的带来安全隐患间。因此，考察联苯节哇乳膏中的抑菌剂和抗氧剂含量，对于评价其处方合理性、降低不良反应具有重要指导意义。
目前未见同时筛查并定量测定联苯茉瞠乳膏中多种抑菌剂和抗氧剂的报道，为了考察国产联苯节哩乳膏中抑菌剂和抗氧剂使用情况，根据2018年国家评价性抽验企业反馈资料中涉及的抑菌剂和抗氧剂，结合FDA药物非活性成分数据库及相关文献资料⑺叫建立了高效液相谱（HPLC）法同时测定联苯节哩乳膏中8种抑菌剂和1种抗氧剂的含量，以期为有效控制相关产品质量提供参考依据。
1材料
1.1主要仪器
Agilent1260高效液相谱仪（配置四元泵、DAD检测器、柱温箱、OpenLAB工作站，安捷伦公司）；
Mettler-Toledo XS105DU电子分析天平（梅特勒公司）：Milli-Q A10型超纯水仪（密理博公司）。1.2主要试剂
对照品：山梨酸（批号190126-201501，质量分数99.6%）：苯甲酸（批号100419-201703，质量分数99.9%）：苯甲醇（批号190019-201702，质量分数100.0%）；尼泊金甲酯（批号100278-201404，质量分数100.0%）；尼泊金乙酯（批号100847-201203，质量分数100.0%）；尼泊金丙酯（批号100444-201102，质量分数99.6%）：尼泊金丁酯（批号110792-200503，质量分数100.0%）；二丁基羟基甲苯（以下简称BHT）（批号190065-201602，质量分数99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；苯扎漠技（批号F023U0，质量分数100.0%）购自USP REFERENCE STANDARDo甲醇为谱纯（Fisher Scientific），水为超纯水，乙酸镀为分析纯。
联苯节哇乳膏来自13家生产企业（A北京华素制药股份有限公司、B遂成药业股份有限公司、C拜耳医药保健有限公司、D山东方明药业集团股份有限公司、E上海延安药业（湖北）有限公司、F江苏晨牌邦德药业有限公司、G黑龙江天龙药业有限公司、H福建太平洋制药有限公司、I湖北东信药业有限公司、J江苏远恒药业有限公司、K海南皇隆制药股份有限公司丄上海通用药业股份有限公司、M南京白敬宇制药有限责任公司），共37批次，规格为1%。企业A的乳膏不含本研究检测的8种防腐剂和1种抗氧剂，所用辅料基质基本与其他厂家样品相同，故作为阴性样品使用。
黑帮之地22方法
2.1谱条件
谱柱为CAPCELL PAK ADME（250mm X 4.6mm,5|im）；流动相为0.02mol/L乙酸鞍（A）-甲醇（B），按表1梯度洗脱；体积流量1.0mL/min；柱温30°C；检测波长218nm；进样量20叫
表1
Tab1
梯度洗脱程序
Gradient program
时间/min流动相A/%流动相B/%
0〜2955
2〜56040
5〜106040
10〜202080
20〜372080
37〜40955
2.2溶液制备
2.2.1混合对照品溶液精密称取山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠鞍和BHT对照品适量，置同一量瓶中，加80%甲醇溶解并定量稀释制成含山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠镀和BHT496.2＞521.4, 1247、50
3.7、506.5、506.3、501.2、202.6、505.1pg/mL 的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液2.0mL，置于10mL量瓶中，用80%甲醇溶液稀释成混合对照品溶液。
2.2.2供试品溶液精密称取样品0.5g，置于20mL量瓶中，加80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45pm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.3空白溶液取80%甲醇溶液作为空白溶液。
2.2.4阴性供试品溶液精密称取企业A样品0.5g，置于20mL量瓶中，加80%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45pm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3方法学考察
2.3.1专属性考察精密量取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液和空白溶液各适量，按“2.1”项下谱条件进样测定，记录谱图。在该谱条件下，各待测组分均能达到基线分离，分离度均＞1.5，理论板数均＞5000，其他杂质对测定无干扰，见图1。
缶乂；钳吋总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月・2441•
C 表2联苯节醴乳膏中抑菌剂和抗氧剂的回归方程及线性
范围
Table2Regression equation and line range of
bacteriostats and antioxygenin Bifonazole Cream
成分回归方程
线性范围/
r
类石墨烯
(|ig-mL')山梨酸7=73.40x+42.96 1.00009.924〜198.5苯甲酸y=70.54x+18.79 1.000010.43〜208.6苯甲醇y=27.45x+16」20.999924.94〜49&7尼泊金甲酯y=46.53x+207.00.999310.07〜201.5尼泊金乙酯y=42.45x+180.00.999310.13〜202.6尼泊金丙酯y=39.48x+152.20.999410.13〜202.5尼泊金丁酯_y=37.59x+129.30.999610.03〜200.5苯扎漠鞍7=13.81x+44.78 1.0000 4.053〜81.04 BHT7=38.24x-6.029 1.000010.10〜202.0
0510152025303540
//min
1■■山梨酸；2-苯甲酸；3-苯甲醇；4-尼泊金甲酯；5■尼泊金乙酯；6-尼泊金丙酯；7-尼泊金丁酯；8-苯扎漠钱；9-BHT；10■联苯节哇
1-sorbic acid：2-benzoic acid；3-benzyl alcohol:4-methylparaben:5-ethylparaben；6-propylparaben:7-butylparaben；8-benzalkonium bro
mide；9-BHT:10-bifonazole
图1混合对照品溶液(A)、供试品溶液(B)、空白溶剂(C)和阴性供试品溶液(D)HPLC谱图
Fig.l HPLC Chromatograms of mix reference solu-tion(A),test solution(B),blank solution!C)and negative
test solution!D)
屈平词赋悬日月2.3.2线性关系精密量取“221”项下混合对照品储备液2.0mL，分别置于5、10、20、25、50、100mL 量瓶中，用80%甲醇溶液稀释成线性系列对照品溶液，按“2.1”项下谱条件试验，记录峰面积。以峰面积(y)对各对照品质量浓度(x)进行线性回归分析，计算各组分的回归方程，各对照品组分线性关系良好，结果见表2。
2.3.3检测限与定量限精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液适量，逐级稀释，按“2.1”项下谱条件，进样测定，记录峰面积。当信噪比为3：1时，得检测限；当信噪比为10：1时，得定量限。山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠镀和BHT的检测限分别为0.23、0.26、4.51、0.35、0.36、0.37、0.41、1.22、1.86|ig/mL，定量限分别为0.78、0.88、15.02、1.17、1.19、1.22、1.38、4.05、6.20yg/mL。
2.3.4精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠鞍和BHT的峰面积RSD分别为0.73%、0.72%、0.77%、1.09%、0.74%、1.46%、1.36%、1.34%、0.71
%("=6)，表明方法精密度良好。
2.3.5回收率试验取空白乳膏样品(企业A提供) 0.5g，分别精密加入混合对照品储备液1.6,2.0,2.4mL，每个浓度各3份，按供试品溶液制备方法操作并测定含量，计算平均回收率。山梨酸、苯甲酸、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯、苯扎漠较和BHT的平均回收率分别为99.8%(RSD为0.5%)、99.8%(RSD为0.8%)、99.9%(RSD为0.7%)、100.9%(RSD为0.7%)、99.4%(RSD为0.6%)、100.7%(RSD为 1.0%)、100.8(RSD为0.6%)、99.3%(RSD为1.4%)和98.6%(RSD为1.1%)。
2.3.6稳定性试验取含不同抑菌剂的同一批号的乳膏样品按“222”项下制备供试品溶液，分别于溶液制备后的0、5、10、20、40h进样分析，山梨酸(企业D，批号1711131)、苯甲醇(企业C，批号BJ40038)、尼泊金乙酯(企业B，批号1704031)、苯扎漠鞍和BHT(企业F，批号201705311)的峰面积RSD分别为1.5%、0.8%、1.4%、1.8%和1.7%，表明在15七避光条件下，供试品溶液中的抑菌剂和抗氧剂在40h内稳定。取“221”项下混合对照品溶液，分别于0、5、10、20、40h进样分析，研究中的8种抑菌剂和抗氧剂BHT的峰面积RSD均小于2.0%，表明
•2442・黑必；丰侍环丸Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月
在15°C避光条件下，混合对照品溶液中的抑菌剂和抗氧剂在40h内稳定。
3结果
取37批乳膏样品，按“222”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项谱条件下进样测定，记录峰面积并计算抑菌剂和抗氧剂的含量，各批次均未检岀苯甲酸、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯。检出山梨酸、苯甲醇、尼泊金乙酯、苯扎漠钱和BHT，见表3。
表3联苯节哇乳膏中抑菌剂和抗氧剂的检出情况
Table3Bacteriostats and antioxygen that be detected in Bifonazole Cream
企业批号成分
标示量/
(mg g')
测定量/
(mg g')
企业批号成分
标示量/
(mggT
测定量/
(mg g')
A1710171———2018011610.12 1504243———2017112810.12 1702061———2017110810.11 B17
04031尼泊金乙酯0.200.212018041810.11 17040210.20G170904尼泊金乙酯0.090.08 17040220.211701030.08 17101810.211709010.09 B1704031苯扎漠钱0.020.02H160401尼泊金乙酯0」00.10 17040210.021706020.09 17040220.021607010.11 17101810.02I170704———C BJ40038苯甲醇 1.000.94170202———
BJ263580.93170703———D1711131山梨酸0.300.26J17092804尼泊金乙酯0」00.10 17022820.24161124010」2 E20170101———170110010.11 F201705311尼泊金乙酯0.090.0817*******.10 2017050510.09K20170201尼泊金乙酯—0.10 2018011610.1020160801—0」0 2017112810.09L161102尼泊金乙酯0.200.21 2017110810.101611010.20 2018041810.09M BCA170901尼泊金乙酯0.100.10 F201705311BHT0」00.10BCA1707030.10 2017050510.12
"一"未检出
爱白网*"—"undetected郑州牧专教务管理
4讨论
4.1检测波长的选择
釆用二极管阵列检测器在190-400nm波长进行扫描，结果显示，山梨酸和尼泊金酯类在254nm 波长处
、苯甲酸在230nm波长处、苯甲醇和苯扎漠钱及BHT在218nm波长处有最大吸收；考虑到苯扎溟鞍和BHT的处方含量较低，而其他组分在218 nm处也有较高的响应，因此选择218nm作为检测波长。
4.2提取条件的选择
通过比较不同比例含水甲醇作为溶剂的提取效果，发现纯甲醇为提取溶剂时，谱中杂质峰较多，而当溶剂中的含水量高于20%时，乳膏样品的浑浊度显著上升，唯以滤过，最终确定80%的甲醇溶液为本试验的提取溶剂。
4.3谱柱的选择
由于山梨酸、苯甲酸、苯甲醇和苯扎漠鞍极性较大，而尼泊金酯类和BHT极性较小，所测定的组分极性跨度大，曾试用Agilent TC-C18谱柱和Agilent ZORBAX SB-C18谱柱均不能有效分离所有组分，换用金刚烷基键合相的CAPCELL PAK ADME谱柱后，分离效果有很大改善，故选定
名玷；钳吋总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月・2443・
CAPCELL PAK ADME谱柱作为研究用柱。
4.4流动相的选择
参考文献的谱条件，比较了甲醇-0.02mol/L乙酸鞭、乙睛-0.02mol/L乙酸镀等度洗脱和梯度洗脱，发现乙睛洗脱力较强，部分组分岀峰过快，改变梯度后依然分离不佳，故选用甲醇-0.02mol/L乙酸钱为流动相，并优化梯度洗脱程序，使各组分出峰时间适宜并分离良好。
4.5样品测定结果分析
结果显示，9家企业的抑菌剂和抗氧剂含量均在处方量的80%〜120%；企业A、E、I处方中不含本研究中的8种防腐剂和BHT，但含有2种抑菌剂重氮烷基JR和三氯叔丁醇，这2种抑菌剂在本谱系统中无响应(数据见表3，典型谱图见图1D)，采用HPLC-CAD和GC-FID分别测定后，结果与企业处方标示量相符。企业K检岀了其说明书中未标注的尼泊金乙酯。分析测定结果发现，不同企业的联苯节瞠乳膏中尼泊金乙酯含量差异较大，最高值0.26mg/g约为最低值0.08mg/g的3倍，建议企业应根据《中国药典》2015年版四部通则的抑菌效力检查法，进一步优化处方，以保证其抑菌剂用量是最低有效剂量。
4.6建立抑菌剂和抗氧剂筛查方法的必要性
《药品说明书和标签管理规定》第十一条规定，非处方药的药品说明书应列出所用的全部辅料名称。本次实验发现个别企业说明书不规范，检出了说明书中未标注的抑菌剂，说明由于目前乳膏中的抑菌剂和抗氧剂缺乏法定测定方法，个别企业可能违规投料或擅改工艺，存在监管风险。建立通用有效的
检测方法，对于填补联苯节瞠乳膏中抑菌剂和抗氧剂的监测空白，开展相关产品的的质量评价，具有重要意义。
本实验建立的测定方法，操作简便、结果准确，可同时测定联苯茉哇乳膏中8种抑菌剂和1种抗氧剂的含量，为联苯节瞠乳膏的质量控制提供了参考依据。
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