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０１６８３
黄伟伟１ 卢建１ 董云巧１ 陈创奇１ 杨曦２ 尹爱华１
（１．广东省妇幼保健院，广东广州 ５１１４００；２．河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 ４７１００３
）【摘要】 目的 应用微阵列比较基因组杂交技术（ａＣＧＨ）对移植前胚胎进行染体遗传学筛查，建立胚胎染体非整倍体检测方法。方法 对冷冻囊胚、对照质控品先进行全基因组扩增，然后再继续ａＣＧＨ检测。结果 ４个冷冻囊胚中１个染体正常，另外３个染体异常，对照质控全部检测出。结论 应用全基因组扩增以及ａＣＧＨ技术，对囊胚成功进行了植入前遗传学筛查，能够全面评估胚胎染体的非整倍体情况，为复发流产患者提高生殖成功率提供重要依据。 【关键词】 全基因组扩增；比较基因组杂交；非整倍体；植入前遗传学筛查【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ
犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐ
ｄ．２０１６．０３．００４基金项目：国家自然科学基金青年科学基金（３１４０１１３６）；广东省自然科学基金（Ｓ２０１２０１０００８３１８
） 通信作者：尹爱华，Ｅ ｍａｉｌ：ｙｉｎａｉｗａ＠ｖｉｐ
．１２６．ｃｏｍ【犃犫狊狋狉犪犮狋】 犗犫犼犲犮狋犻狏犲 Ｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｏｆｍｉｃｒｏａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ａＣＧＨ），ｔｈｅａｉｍｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｔｏｃａｒｒｙｏｕｔｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃ ｔｉｏｎｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ．犕犲狋犺狅犱 Ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）ｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｔｈｅｆｒｏ ｚｅｎｂｌａｓｔｏｃｙｓｔａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｓａｍｐｌｅｓ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＷＧＡｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙａＣＧＨ．犚犲狊狌犾狋狊 Ｏｎｅｏｆｔｈｅｆｏｕｒｆｒｏｚｅｎｅｍｂｒｙｏｓｗａｓｎｏｒｍａｌ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｏｔｈｅｒｓｗｅｒｅａｂｎｏｒｍａｌ．Ｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｈａｖｅａｌｌｂｅｅｎｓｕｃ ｃｅｓｓｆｕｌｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄ，ｊｕｓｔａｓｅｘｐｅｃｔｅｄ．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀狊 ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＷＧＡｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈａＣＧＨｈａｓｂｅｅｎｐｒｏｖｅｄｔｏｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｉｎｅｍｂｒｙｏｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅ
ｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｉｔｃａｎｈｅｌｐｔｏｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｎｅｕｐｌｏｉｄｙｉｎｅｍｂｒｙｏｓ，ａｎｄｔｈｕｓｐｒｏｖｉｄａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｒｅｐｒｏ ｄｕｃｔｉｖｅｓｕｃｃｅｓｓｒａｔｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｒｅｃｕｒｒｅｎｔｓｐ
ｏｎｔａｎｅｏｕｓａｂｏｒｔｉｏｎ．【犓犲狔狑狅狉犱狊】 ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）；ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ａＣＧＨ）；ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ；ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
（ＰＧＳ） 辅助生殖中常出现胚胎发育停滞、
反复种植失败及多次自然流产，原因多为胚胎染体异常、非整倍体为主要因素，包括单体、三体（常见１３、１５、１６、１８、２１、２２
楼恒伟案、和Ｘ）及嵌合体等。有研究显示，流产胚胎的５０％～６０％左右存在染体核型异常［１］。胚胎植入
前遗传学筛查（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＰＧＳ）便是一种在体外受精后活检，进行染体非整倍性筛查，选择染体整倍性的胚胎植入，提高胚胎妊娠成功率和降低流产率的辅助技术，是一种低风险
的植入前遗传学检测技术［
１
］。染体行微阵列比较基因组杂交（ａｒｒａｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａＣＧＨ）检测，
一次可以检测所有的染体数目异常以及每条染体全长的情况［
２ ４
］。对复发流产患者进行ＰＧＳ检测，
以期能提高辅助生殖成功几率［５
］。１ 资料与方法
１．１ 研究对象 胚胎：选取本院生殖健康与不孕症科行体外受精胚胎移植并已分娩正常婴儿的患者冻存的受精胚胎，常规解冻后存活的胚胎用于本研究。患者夫妇均自愿放弃冷冻胚胎，同意捐献用于科研，签署知情同意书。１．２ 方法
１．２．１ 胚胎活检可活检 将冷冻的胚胎复苏，
用激１２
２
０１６８３光在透明带空隙较大处打孔，然后换囊胚培养液行囊胚培养，在显微操作仪下用固定针避开内细胞团固定囊胚，
活检针从扩张出的滋养层细胞处吸取４～１
０个细胞，边抽吸边用激光从细胞连接处打断后吸取细胞团。活检获得的滋养层细胞，用１×ＰＢＳ（ｓｉｍｇａ，美国）各洗涤３遍，移入预先加入５μｌ无核酸水的ＰＣＲ管中。
１．２．２ 全基因组扩增 采用试剂盒ＷＧＡ４（美国Ｓｉｇ
ｍａ）对单细胞进行全基因组扩增（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＷＧＡ），设置末次洗涤液作为空白对照，正常男性为参考ＤＮＡ（１００ｐｇ）［６］，大头蚁属
１３、１８、２１ 三体ＤＮＡ（１００ｐｇ）作为阳性对照，正常女性ＤＮＡ（１００ｐｇ）作为阴性对照。ＷＧＡ４包括细胞裂解ＤＮＡ片段化、
扩增前处理和扩增３个步骤。ＷＧＡ的扩增产物用１．２ｇ／Ｌ琼脂糖凝胶电泳检测。１．２．３
染体非整倍性筛查 采用美国ａｇｉｌｅｎｔ公司ａＣＧＨ芯片检测系统。待检胚胎和正常男性参考ＤＮＡ、１６、１８、２１ 三体、正常女性ＤＮＡ经过全基因组扩增后，各取１３μｌ经过荧光标记、纯化、杂交、洗涤、扫描等步骤获得扫描图片，ＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃ ｔｉｏｎ１０．７．３．１软件（美国ａｇｉｌｅｎｔ公司）进行图片数据提取，应用ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓ２．７．８软件（美国ａｇ
ｉ ｌｅｎｔ公司）进行染体分析。具体实验流程参考ａｇｉｌｅｎｔ公司的ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｒｒａｙ ＢａｓｅｄＣＧＨｆｏｒＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌＡｎａｌｙｓｉｓ标准操作规程（ｗｗｗ．ｇｅ ｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）。２ 结果
从电泳图上（图１）可以看出，除空白对照外，其余样品均扩增出弥散带，说明ＷＧＡ４扩增成功
。
图１ 全基因组扩增产物电泳
Ｍ：
ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，１：正常男性参照，２：正常女性对照，３：１６ 三体对照，４：１８ 三体对照，５：２１ 三体对照，６ ９：４个囊胚，１０：
空白对照 数据分析软件ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓ２．７．８使用ＡＤＭ ２（ＡｂｅｒｒａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄ ２ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）算法阈值为６．０，染体缺失探针的阈值ｌｏｇ２为０．４５，染体重复探针的阈值ｌｏｇ２为０．３５，经过ａＣＧＨ分析，三个阳性对照分别检查出１３、１８、２１ 三体，也检测出正常女性对照；４个囊胚分别为：正常、１４ 三体、１８和２１ 三体、２２单体，
小哥白尼趣味科学
如图２所示
。图２ ４个囊胚的ＰＧＳ分析结果
以正常男性为对照，２ａ：正常女性；２ｂ：１４ 三体；２ｃ：１８和２１ 三体；２ｄ：２２单体
２２
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３ 讨论
单细胞２４条染体非整倍体分析，非常重要的第一步就是进行全基因组扩增，由于单细胞ＤＮＡ的含量仅为６～７ｐｇ（Ｄｏｌｅｚｅｌｅｔａｌ．，２００３），而微阵列芯片检测需要纳克级的ＤＮＡ才能进行，所以开展ＰＧＳ需要进行全基因组扩增。目前，全基因组扩增主要基于３种原理［７］：①聚合酶链式反应（ｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ），使用随机引物或部分随机引物通过热循环扩增，对随机片段化的ＤＮＡ进行扩增，以Ｓｉｇｍａ公司的“ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ”技术为代表（ＷＧＡ４）；②多重置换扩增（ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｉｓｐｌａｃｅ ｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ），是一种非ＰＣＲ的扩增技术，在恒温条件下，使用Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶、随机引物进行全基因组扩增，Ｐｈｉ２９ＤＮＡ聚合酶具有较高的扩增效率和保真性，扩增产物大于１０ｋｂ，以Ｑｉａｇｅｎ公司的“ＲＥＰＬＩ ｇ”技术为代表；③多
重退火环状循环扩增（ｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｎｅａｌｉｎｇａｎｄｌｏｏｐｉｎｇ ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｙｃｌｅｓ，ＭＡＬＢＡＣ），该法通过准线性预扩增来降低非线性产物，使用由２７个碱基的特异接头和８个碱基的随机序列组成的引物，在０℃时引物均匀地杂合到模板ＤＮＡ上，６５℃时具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶发生作用，生成０．５～１．５ｋｂ中间产物，而后９４℃发生变性，接着５８℃退火，这些中间产物作为模板聚合形成两端序列反向互补的环状产物（避免产物交叉杂交），５个循环后进行ＰＣＲ，产物可达到数微克［８］。
ＰＣＲ全基因组扩增和ＭＤＡ全基因组扩增方法，临床应用较为普遍，ＮａｔｈａｎＲ．Ｔｒｅｆｆ［９］将ＰＣＲ基础的全基因组（ｓｉｍｇａＷＧＡ４试剂盒）和ＭＤＡ全基因组扩增（ｑｉａｎｇｅｎＲＥＰＬＩ ｇ试剂盒、ＧＥＧｅｎｏｍｉＰｈｉＤＮＡ扩增试剂盒）进行了比较，发现ＷＧＡ４试剂盒更适合进行微阵列拷贝数变异分析（ＣＮＶ）。ＭＡＬＢＡＣ全基因组扩增方法由ＺｏｎｇＣｈｅｎｇｈａｎｇ［８］２０１２年首次提出，目前临床应用较少，但其优越性较其他几种扩增方法显而易见，相信以后会是微阵列和二代测序重要的伴侣。全基因组扩增必须在没有序列倾向性的前提下大幅度提高ＤＮＡ的总量，但是没有一种全基因组扩增方法能保
证单细胞扩增的线性，主要涉及等位基因丢失、等位基因扩增不一致等，有可能会导致ａＣＧＨ无法准确检测出相应的染体缺失或重复，不同的芯片检测平台，需要应用其适应的ＷＧＡ方法［３］。我们使用ＰＣＲ基础的Ｓｉｇｍａ公司ＷＧＡ４试剂盒，能明显地检测出１３、１８、２１ 三体３个
阳性对照和１个正常女性对照，囊胚细胞的ＰＧＳ检测的结果也显著。
ＰＧＳ获取生殖细胞或胚胎组织的方法主要有２种：卵裂球活检及囊胚细胞活检。卵裂球活检：体外授精后第３天，胚胎发育到６～１０细胞期，从中取出１～２个卵裂球行染体分析，卵裂期染体嵌合发生率较高，此时的染体分析可能代表不了胚胎的染体组成［１０］。囊胚细胞活检（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｂｉｏｐ ｓｙ）：在体外授精后的第５天或第６天进行，胚胎发育成滋养外胚层细胞（发育为胎盘）和内胚层细胞（发育为胎儿）［２］。囊胚期ＰＧＳ只取滋养外胚层５～１０个细胞进行检测，而保持了胎儿的内胚层细胞的完整性［１１］。另外从卵裂球到囊胚期发育过程中，染体有问题的细胞会被自然淘汰；在囊胚期较卵裂期取得的单细胞量大，ＰＧＳ分析结果更加稳定。随着囊胚培养、胚胎冷冻和解冻技术的提高，囊胚滋养外胚层活检凭借其对胚胎损伤小、染体整倍性比率高、嵌合少的优点，已逐渐被临床推广应用［１］。ＰＧＳ阳性对照、正常女性对照的检测结果与样品类型一致；活检的４个囊胚中１正常，其余３个异常。本实验结果表明，应用ａＣＧＨ技术成功建立了一种对早期胚胎进行植入前遗传学筛查的方法。
ＰＧＳ使产前筛查检测时间已经从孕１１～１３周提前到胚胎植入前，为更好的降低出生缺陷提供了帮助。传统的荧光原位杂交技术也能用于ＰＧＳ，但只能对３～７对染体的检测，不能完全反映２３对染体的总体状况。ａＣＧＨ应用于ＰＧＳ，不需要针对异常位点制备特殊的探针，一次可以检测２４条染体非整倍体数目异常以及染体重复和缺失，并且能获得异常片段的位置和大小，该技
术具有通量高、灵敏度高等特点，可以在２４小时完成检测。虽然ａＣＧＨ应用于ＰＧＳ有许多优点，但该技术也存在一定的局限性，检测分辨率只有５～１０Ｍｂ，另外ａＣＧＨ不能检测出点无染体拷贝数变化的结构异
３
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０１６８３常，如平衡易位和倒位等，对嵌合体、多倍体和单倍体的检测能力。
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ｄａｔｅ，２０１１，１７（４）：４５４ ４６６．（收稿日期：２０１６ ０５ ３０
）编辑：宋文颖
·视频导读·
mtg荷兰和欧洲开展的产前无创筛查（犖犐犘犜）
ＤｉｃｋＯｅｐ
ｋｅｓ（荷兰莱顿大学医学中心产科
）
来自荷兰的ＤｉｃｋＯｅｐｋｅｓ教授一直是胎儿大会的座上嘉宾，他的讲课也一直深受广大学员的喜爱。
在第六届中国胎儿医学大会上，ＤｉｃｋＯｅｐｋｅｓ教授向我们分享了荷兰以及欧洲在开展产前无创筛查（ＮＩＰＴ）方面的政策和经验。
荷兰是一个拥有１７００万人口的欧洲小国，在医疗方面，荷兰实行全民医保，每个家庭都有自己的家庭医生；全国共８０家医院，专科医生只接收由家庭医生转诊的病人，全年大约有１８万孕妇。ＤｉｃｋＯｅｐ
ｋｅｓ教授详细讲述了产前筛查在荷兰的发展史，学习这些发展历程对认识我国ＮＩＰＴ的发展能起到一定的作用。
犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐ
ｄ．２０１６．０３．００５４２
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