王莹，马伊鸣
（北京交通大学 土木建筑工程学院 环境1402班）
摘 要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词： 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建
Macro summary of Metagenomics
榆林杀人案Wang Ying, Ma Yi-Ming
（BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,）
Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics
宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA（也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源
宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。
2 研究对象
宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。
3 研究方法
宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。氢的同位素>高分子材料成型加工 图1 环境微生物宏基因组学研究过程
Fig. 1 General process of metagenomic strategie
3.1 环境样品及目的基因组富集
在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总 DNA 的一小部分, 对环境样品的预富集可以大大提高目的基因的检出几率。目前预富集技术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。其中细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对目的微生物进行富集培养, 最常用的方法是底物选择, 此外还包括营养选择及物理化学指标选择。但是由于富集培养选择性地富集了具有快速生长特性的菌, 因此导致大部分物种多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁迫条件下短期处理, 然后改为较温和的处理条件, 可以从一定程度上克服这种方法的局限性。基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术(SIP), 原理是采用稳定同位素标记底物, 其中的“重”原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中, 采用密度梯度离心的方法将“重”的 DNA 与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为 PCR 的模板, 用来构建宏基因组文库。例如采用 C 标记的甲醇研究森林土壤宏基因组 DNA, 结果鉴定出变形细菌 α-亚纲中所有已知
的嗜甲基菌, 并在一种嗜酸菌中发现了新的甲醇还原酶基因。此外, 还有报道利用抑制性消减杂交技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获技术及 DNA 微阵技术等技术来富集目的基因。
3.2宏基因组 DNA 的提取
获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总 DNA 是宏基因组文库构建的难点之一。近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类: 一类是直接提取法, 又称原位提取法。这类方法不经过样品中微生物的培养和分离, 通过化学法、酶解法或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使 DNA 得以释放, 并对 DNA 进行纯化。其中以 Zhou 法和 Tsai法最为常用。该法操作简便、省时、成本低, 所获得 DNA 具有较好的完整性, 并能够代表某一生境的微生物落多样性。但该发放常会出现细胞裂解不完全或 DNA 与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效地去除等问题, 所以一般需要进一步的DNA纯化处理毒牙, 同时所提取获得的 DNA 片段较小(1 kb~50 kb), 主要适用于小片段文库的构建; 另一类是间接提取法, 即异位提取法, 是利用离心介质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分离出来, 再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞提取 DNA。该法获得的宏基因组 DNA 受
到胞外杂质污染干扰较少, 纯度较高、DNA 完整性好(20 kb~500 kb), 适合构建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费时、成本高、偏差大、DNA 得率较低, 其产率只是直接裂解法的 1%~10%且获得的 DNA 往往不能完全代表样品所在生境的生态学多样性。本实验室对温泉淤泥、纸厂污泥、红树林淤泥、沼泽淤泥等 12 个环境样品的总 DNA 提取方法进行了摸索, 研究工作表明，直接提取法提取效率较高, 不容易丢失物种信息, 能够获得 23 kb 左右的 DNA 片段。并首次加入漆酶来有效去处腐殖酸类物质, 比聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP)处理效果更好, DNA 得率更高。而间接提取法 DNA 提取效率较低, 容易丢失物种信息。因此, 建议采用直接提取法获得环境样品的总 DNA, 以便分析环境样品微生物落多样性信息。
红河学院学报
3.3 宏基因组文库的构建
3.3.1 载体的选择
载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的地位。载体系统的选择主要依赖于DNA 提取质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库可分为质粒文库、细菌/酵母人工染体文库、噬菌体类载体文库。早期宏基因组文库主要以质
粒载体和大肠杆菌宿主细胞构建而成的小片段(<15 kb)文库。该文库操作简便、拷贝数高、对 DNA 质量要求不高, 适合纯度低或剪切较严重的 DNA 模版。但插入片段小, 筛选量大, 活性比率低, 对大基因簇无能为力, 主要适用于分析新的基因序列信息及筛选编码代谢相关的单一基因或小操纵子。然而, 很多微生物活性物质是其次生代谢产物, 代谢途径由多基因簇调控, 因此尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的, 目前已有报道能容纳15 kb~40 kb外源DNA的 Fosmid 文库和Cosmid 文库, 同时已经成功构建了容量高达 200 kb~350 kb 外源 DNA 的细菌人工染体文库和酵母人工染体文库。该文库不仅拥有巨大的插入片段载量, 而且稳定性好、筛选效率高、克隆表达能力强, 可获得基因簇表达活性物质。主要用于分析某一生境中微生物落多样性及筛选由基因簇或多个基因控制表达的活性物质。但其操作较复杂繁琐、对 DNA 沙棘真假怎样鉴别纯度要求较高, 且拷贝数低, 扩增较困难。此外, λ-噬菌体和其他病毒也可以作为构建宏基因组克隆文库的载体。噬菌体展示库是一种十分有效的高通量筛选技术, 该技术通过对表面展示表达产物的亲和选择分离相应的 DNA 序列，能够从宏基因组中富集稀有 DNA 序列，但其局限性在于只能表达分子量小于50kD蛋白。
3.3.2宿主细胞的选择
不同的微生物种类所产生的活性物质类型有明显差异。宿主菌株的选择主要考虑转化效率、重组载体在宿主细胞中的稳定性、宏基因的表达、目标性状(如抗菌)缺陷型等因素。其中 E. coli是最为常用的宿主细胞，其优点是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制。但是由于环境样品的总 DNA 有很大一部分为真核基因组 DNA, 其在细菌宿主中往往不能表达, 大大限制了这部分基因的筛选。最近已有报道利用链霉菌、假单胞菌等真菌作为受体来鉴定有关新抗生素生物合成的基因。但是最近的生物信息学研究表明, 对于一个插入子(<10 kb)的文库, 为寻一个目的基因需要筛选 105~106 个克隆, 这表明从复杂的宏基因组中筛选目的基因在技术上还存在着其特殊的困难。因此, 宿主系统的进一步探索是更有效的开发宏基因组资源的关键技术之一。
3.4宏基因组文库筛选
由于宏基因组文库容量较大, 目标克隆子的筛选一直是宏基因组学技术中的瓶颈。近年来, 各种宏基因组文库筛选方法相继建立起来, 根据筛选原理大体分为两大类: 序列依赖性筛选法和非序列依赖性筛选法。
1) 序列依赖性筛选法, 是根据文库中的已知序列或保守序列来设计杂交探针或 PCR 引物,
从宏基因组文库中筛选目标序列。该法克服了功能筛选法中必须依赖表达后的活性产物进行检测, 效率较高。其中已知功能基因 PCR 扩增技术是最为常用的序列依赖性筛选法。此外, DNA 微阵技术和整合子系统技术也可以作为序列依赖性筛选法。例如 Wagner 等应用 DNA 微阵列技术对活性污泥中微生物的落结构进行了研究, 获得了大量新的信息, Stokes 等利用整合子系统技术成功筛选到与 DNA 糖苷酶、磷酸转移酶和甲基转移酶同源的新基因。但是该筛选法存在 2 个主要的缺陷: (1) 引物的设计依赖于已有的序列信息, 共同进化的 2 个功能相似的基因难于用“族特异性”引物区分开来, 因此很难发现新的功能基因; (2) 通过 PCR扩增功能基因, 一般只能获得结构基因的一个片段, 而不能获得完整的功能基因。
2) 非序列依赖性筛选法, 其不依赖于任何已知序列信息, 仅根据文库克隆子产生的活性物质进行筛选。其中以功能筛选法最为常用, 原理是直接对目的克隆表达的性状在选择培养基上进行筛选, 已有报道成功筛选出产生木聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶及抗菌活性的克隆子。该法筛选能够发现全新的活性物质或全长基因, 但工作量大、效率低, 生物转化的产物仅在少数情况下具有可见性状, 酶活性的检测受到研究方法的限制。此外, 由于受到酶活检测方法的限制, 大多数宝贵的酶资源不能通过上述基于活性的方法发掘出来, 近期基因陷阱技术筛选法倍受研究学者们的关注。其中, (1) 利用目的基因缺失的突变体宿主菌株, 转化后在
选择性培养基上进行功能互补的生长特征来筛选。例如 Majernik 等通过缺陷型大肠杆菌为宿主菌构建土壤宏基因组文库, 筛选出了与 Na+/H+反向转运通道相关新基因; (2) 将宏基因组 DNA 随机克隆到无启动子的绿荧光蛋白基因(GFP)前面, 然后通过荧光激活细胞分离(FACS)技术, 在添加特定底物的条件下对表达库进行富集, 就能够选择出对该底物具有代谢活性的克隆。如 Uchiyama 等利用底物诱导基因表达法从环境宏基因组文库中筛选到新的生物代谢相关基因; Williamson 等利用底物诱导基因表达法从泛洪区土壤宏基因组文库中筛选到新的生物小分子物质。该法优点在于它为高通量筛选提供了保障, 而且不需要对底物进行修饰, 尤其适合于工业生产上的应用。但也存在一些问题: (1) 无法利用不能进入细胞质的底物; (2) 荧光激活细胞分离仪(FACS)对进样设备的要求也比较高; (3) 建立高度耐受“超相容性”表达系统, 以表达任意来源的编码蛋白和酶具有一定难度。
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