免疫组化结果分析篇1：免疫组化（IHC）经验超全总结
做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时 间去积累和摸索经验。我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理 相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想, 最终结果未能达到预期的效果。经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合 实践操作，我经历了初级一一查资料和摸索方法；中级一一问题求助和不断总结：髙级一 —难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起 分享。 要求做冰冻切片的不一泄能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡 切片时要髙温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳左，则可作石蜡切片： 但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。 冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这 一
步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散：切片厚度较石蜡的厚, 做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做 冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较 麻烦，一立要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解, 保存一贯很重要。由于石蜡切片可以切到左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去, 容易成功，而且得到的颜/形态都较冰冻切片好。
二、 一抗的选择要点和技巧是什么？
单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗 体能目标明确地与单一的特异抗原决左簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。列一方而， 即使是同一个抗原决左簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗 体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对 小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度髙， 但易出现非特异性染（可以通过封闭等避免）。 应用范围的选择。有的一抗只能用于WB （Westernblotting）或免疫组化、免疫荧光、 免疫沉淀等；甚至表明石蜡切片或冰冻切片。
种属反应性的选择。这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合 检测哪种种属动物体内的抗原。
种属来源，一般兔来源的多是多克隆：而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此
来源来选择相应的二抗。
生产厂家的选择。不同厂家的同一种抗体，它的实际效价稳泄是不同的，有的做免疫组 化效果较好，有的WB效果却更好一些。
三、 在什么情况下使用Triton-XlOO?
TritonX-100化学名称为聚乙二醇辛基苯基联，是一种去污剂。在免疫组织化学（10 um 以上厚切片）和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。
其作用原理TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大 分子
结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利 进入胞内与相应抗原结合。
TritonX-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用。
四、 封闭血淸的选择原则是什么？
膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。
封闭血淸一般是和二抗同一来源的，血淸中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反 应的位点发生结合，否则在后而的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
也可以用小牛血淸、BSA、羊血淸等，但不能与一抗来源一致。
五、 抗体孵育条件的比较？
一抗孵冇温度有几种4oC、室温、37oC,其中4oC效果最佳：孵冇时间这与温度、抗体 浓度有关，一般37oC, l-2h,而4oC过夜和从冰箱拿出后37oC复温45min。
二抗一般室温或37oC, 30min-lh,具体时间需要摸索。
六、 一抗4°C孵育后为什么要进行37°C复温？
一方面，防止切片从4oC直接放入PBS易脱片。
另一方而，使抗原抗体结合更稳左。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4oC 和37oC时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏 感性也提高了井易造成非特异染。
其实，我更赞同后一种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4°C过夜拿出后，直接用 PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。
七、DAB显时间如何把握?
DAB显时间不是固定的，主要由显微镜下控制显时间，到出现浅棕本底时即可冲
洗。
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DAB显时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐，这很可能说明你的抗体浓 度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵冇时间。
若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前而的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封 闭时间。
DAB显时间很长（如超过十几分钟）才岀现阳性染，一方而可能说明你的抗体浓度 过低或孵疗时间过短（最好一抗4oC过夜）；另一方面就是封闭时间过长。
八、 免疫组化结果如何分析？
惯性力矩
阳性着细胞讣数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数 阳性着细胞，每组一期缝合3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
灰密度分析法。通过在不同组別和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 imagej进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
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评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染程度（0-3分为阴性着、淡黄、 浅褐、深褐）、阳性范围进行评分（1 -4分为0-25%. 26-50%、51-75%、76-100%）,最终 可以分数相加，再进行比较。
对于以上这几种方法，各有利弊，请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着 均匀、背景很注的高质量切片。
九、 在什么情况下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么？
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固左过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭 作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决左族重新疑露，提高抗原检测率。
修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干 种（具体的可以査阅相关资料，大量的中性的、髙pH的等）。
微波修复，我们一般用6min*4次，效果不错。
十、内源性过氧化物酶的火活时间和浓度是什么？
一般3$过氧化氢灭活时间短点，可以lOmin左右：而欲望号列车0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭 时间，一般 10-30min。
用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS好在保护抗原和固左组织作用，过氧化氢孵冇时间
过长易引起脱片。
现用现配，配好后4oC避光保存。
十一、如何才能充分脱蜡？
蜡不溶于水，如果脫蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染不均匀、阳性物时 隐时现、真假难辨、背景染增加等。为了解决上述的问题，切片在染前必须彻底脱蜡， 目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短：
脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度决泄。如果在夏天，室温较髙，脱蜡试 剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5min就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较 陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20min或更长。
当天切的切片，烧烤2小时后进行染，切片带有温度时进行脱蜡可加速脱蜡的过程， 如果预先切好烤好的切片，在染前，还必须对切片进行加温10-20min,然后再行脱蜡，这 样脱蜡速度加快，效果会更好。
总之，操作时应根据不同的季节，不同的室温，不同的试剂来决泄，脱蜡的时间，原则 上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
十二、如何最大限度地降低组织非特异性染？
缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；
一抗用多克隆抗体易出现非特异性着，建议用单克隆抗体看看；
内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通 过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染：
非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血淸封闭时间和适当增 加浓度来加强封闭效果；
缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等：
适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
吴嘉丽三级防止标本染过程中出现干片，这容易增强非特异性着。
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