仪征市第二中学
抗原抗体知识
抗原 (antigen, Ag)
¨ 抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和 (或 ) 细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:
–免疫原性:引起机体产生抗体和 (或 ) 致敏淋细胞的特性;
–免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
¨ 根据抗原是否显示免疫原性分为:
–完全抗原:分子量较大,一般在 10kDa 以上,并具有较复杂的化学组成。? 免疫原性最强的是蛋白质抗原, 多糖次之; 脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
–半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。
半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。
载体
¨ 通常是具有高度免疫原性的大分子物质, 具有将免疫原性传递给偶联的半抗原能力。
–常用的载体有钥孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 、牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白 (Ovalbumin, OVA) 等。
–用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团 -NH2、 -COOH 等将半抗原结合到载体上。结合比例为 5kDa 结合 5~25个分子的小肽。
(三)抗体 (antibody, Ab)
1、抗体的概念:
¨ 机体受到抗原刺激后, 由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。
–抗体主要存在于血清内;
–抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
–免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既 IgG 、 IgD 、IgE 、 IgA 、 IgM 。
2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。
¨ 单克隆抗体:是一个 B 淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
–特异性强、抗体产量高。
¨ 多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后, 从动物血中所获得的免疫血清,是多个 B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
–特异性低,会产生抗体的交叉反应。
–多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染机会。
–抗原与抗体的结合, 要求量保持一定比例, 当抗原或抗体过量时, 是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
¨ 动物的选择
¨ 免疫方法
¨ 免疫剂量
¨ 抗体效价的测定
¨ 放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于:蚕蛾交尾
¨ 所需抗血清的量
–小鼠只能提供 1.0~1.5ml 的血液,而山羊能提供几升。
¨ 能供免疫用的抗原量
–小鼠 50mg 足够,而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择 (续 )
¨ 动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
–例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
–常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔 (新西兰兔,年轻,健壮,体重在 2.5kg 左右,雄性 ) 为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
¨ 一般可溶性抗原注射后, 迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间, 且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中, 常将抗原和佐剂一起注射。¨ 最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为 :
–弗氏不完全佐剂 (Freund's incomplete adjuvant)
–弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
诺基亚5140
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
¨ 是由油剂 (石蜡油或植物油 ) 与乳化剂 (羊毛脂或 Tween80) 混合而成,比例为 1:1、 2:1、 3:1或 5:1,可根据需要而定,通常 2:1。
¨ 使用时与水溶性抗原按 1:1比例充分混合, 使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)
¨ 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌 (终浓度为 2~
20mg/ml),即成为 FCA 。
¨ 免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后 (油包水 ) 注入动物。–一般首次注射时用完全佐剂乳化, 第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
¨ 研磨法:适于制备大量的佐剂抗原
–先将不完全佐剂加热, 取 1.73ml 放人无菌玻璃研钵内; 缓缓滴入 0.23ml 活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。
–按同样方法滴人抗原, 每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢, 待抗原全部加人后,应成为乳白粘稠的油包水乳剂。
¨ 缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法 (续 )
¨ 注射器混合法
–将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个 5ml 注射器内,然后插入三通管内, 交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
¨ 优点:无菌操作,节省抗原或佐剂。
¨ 缺点:不易乳化,时间长。
佐剂与抗原乳化的方法 (续 )
¨ 快速乳化法:利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
–将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中, 置于超声波粉碎器上, 粉碎头浸入液面下 0.5cm ,离瓶底 0.5cm 左右,以免打碎离心管。
–每次乳化 10~15s ,然后置冰箱 lmin 左右。反复乳化 3~4次即可完全乳化。管内残余量 800r/min离心 5~10min 收集。
¨ 优点:简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
¨ 判断乳化是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上 (冷水中 ) ,如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
¨ 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
¨ 一般采用多点注射方法
–常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。–皮内易引起细胞免疫反应,有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续 )
¨ 几点说明:
–大动物一般不用腹腔注射
–颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
–抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需 10~100mg 抗原即可获得较好的免疫效果。
–皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
宦国苍>上海外轮代理¨ 次数一般为 2~3次 (初次免疫和加强免疫 )
–首次注射后, 10~15天再加强注射;
–剂量同首次或为首次的一半,用不全佐剂或不用佐剂。
¨ 间隔时间,一般而言,动物越大,间隔越长
–豚鼠、大鼠为 7~8天,兔子为 10~15天,羊为 14~28天;
–第三次注射的间隔时间更长些,效果更好。
举例 1:家兔的免疫
¨ 初次免疫
–用 50~200mg Ag加入 FCA ,在背部皮下注射 6~8点,每点 0.1~0.2ml ,也可肌肉内或皮内注射;
¨ 两周后,加强免疫
–将 50~200mg Ag于 PBS 或 FIA 中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射; ¨ 抗体效价的检测:加强免疫一周后,耳缘静脉采血
–抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上,后者在 1:16以上,即可采血,取血清进一步提纯。
举例 2:微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
¨ 一般选择 2.5~3.0kg 的新西兰种公兔
水利水电技术
–先在其两脚垫注射完全福氏佐剂 0.2ml(卡介苗每兔合 5mg) ;
– 10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大的淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化;
–以后每隔 20天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强 2次,各次注射的抗原均为 25~50mg ;
–末次注射两周后兔耳放血测价 (可达 1:128)。
举例 3:豚鼠和大鼠的免疫
¨ 初次免疫
–用 10~100mg Ag 加入 FCA ,在背部皮内注射 4~6点,每点 0.lml ,也可肌肉内或皮下注射;
¨ 加强免疫
–每隔 7~8天, 将 10~50mg Ag于 PBS 或 FIA 中。在肌肉、皮下或静脉注射; ¨ 抗体效价的检测
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