・论著・
白介素21
β表达的影响王敏忠，李春霞，郭守刚，刘雪平，杜怡峰，张苏明
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【摘要】 目的 观察局部亚低温对脑出血大鼠血肿周围脑组织的形态学变化和对白介素(I L )21β表达的影响。方法 72只W istar 大鼠随机分为假手术组和脑出血后6h 、24h 、48h 、72h 、7d 组，每组再分为常温亚组和亚低温亚组，每个亚组6只大鼠。采用自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型。各亚低温亚组注血后实施亚低温4h，维持脑温在(33±0.5)℃。观察血肿周围组织的形态学改变和I L 21β表达的变化。结果 亚低温亚组各时间点脑组织水肿明显轻于常温亚组；神经元变性坏死、炎症反应及胶质细胞增生程度明显轻于常温亚组。脑出血后6h 血肿周围脑组织I L 21 β开始表达,48h 达高峰,7d 时仍明显高于对照亚组(均P <0101)。脑出血24h ～7d 亚低温亚组I L 21
β表达水平较相应时点常温亚组显著降低(均P <0101)。结论 亚低温能明显抑制血肿周围I L 21
β的过度表达，减轻血肿周围脑组织的炎症反应。【关键词】 脑出血；动物模型；白介素21
β；亚低温【中图分类号】R743.34 【文献标识码】A 【文章编号】100421648(2010)0120034204Effects of loca l sub 2hypother m i a on expressi on of i n terleuk i n 21
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βi n bra i n tissue of per i he ma to ma follow i n g i n tracerebra l he m orrhage i n ra ts WAN G M in 2zhong,L I Chun 2xia,G UO Shou 2gang,et al .D eart m ent of N eurology,Shandong Provincial Hospital,J inan 250021,China
Abstract:O bjecti ve To investigate the effects of l ocal sub 2hypother m ia on the changes of hist omor phol ogy and
the exp ressi on of interleukin (I L )21
βin brain tissue of perihemat oma f oll owing intracerebral hemorrhage (I CH )in rats .M ethods 72W istar rats were random ly divided int o sha m 2operati on gr oup,I CH 6h gr oup,I CH 24h gr oup,I CH 72h gr oup and I CH 7d gr oup;each gr oup was divided again int o nor mother m ia sub 2gr oup and sub 2hypother m ia sub 2gr oup,and 6rats in each sub 2gr oup.Rat I CH models were established by aut ol ogous bl ood injecti on .The rats in sub 2hypother m ia sub 2gr oup were given l ocal sub 2hypother m ia therapy i m mediately after the injecti on,and keep the intracerebral te mperature at 3215℃t o 3315℃for 4h .Then,the changes of hist omor phol ogy and the exp ressi on of
I L 21
βin brain tissue of perihe mat oma were observed .Results The brain tissue ede ma,neur onal degenerati on,infla mmat ory reacti on and coll oid cellular p r oliferati on were more seri ous in nor mother m ia sub 2gr oup than in sub 2
hypother m ia sub 2gr oup at every ti m e point after I CH.The exp ressi on of I L 21βwas increased at 6h of I CH,peaked at 48h of I CH and higher than contr ol subgr oup until 7d of I CH (all P <0101).The exp ressi on of I L 21
βin sub 2hypother m ia sub 2gr oup s of I CH 24h ～7d were significantly l ower than those in corres ponding nor mother m ia sub 2
gr oup (all P <0101).Conclusi on Sub 2hypother m ia therapy can significantly inhibit overexp ressi on of I L 21
βand relieve the inflammat ory reacti on in brain tissue of perihe mat oma .
Key words:intracerebral he morrhage;ani m al model;interleukin 21
β;sub 2hypother m ia 基金项目：山东省卫生厅计划项目(2007HW093)
作者单位:250021济南，山东省立医院神经内科(王敏忠，李春霞，郭守刚，杜怡峰)，老年病科(刘雪平)；华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科(张苏明)
通讯作者：杜怡峰
脑出血(I CH )后继发性损伤是影响患者预后的重要因素之一
[1]
，炎症反应参与了这一继发性损伤
机制，其中白介素21β(I L 21
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β)是最受关注的细胞因子之一[2]
。既往对I L 21β的研究主要在颅脑损伤、A lzhei m er 病及脑缺血
[3]
等方面，而其在I CH 中的研
究较少，特别是局部亚低温对I CH 大鼠出血灶
周围组织I L 21
β表达的影响尚不清楚。为此，本实验系统观察了局部亚低温前后I CH 大鼠出血灶周
围脑组织形态学变化及其炎性因子I L 21
β表达的变化，以进一步探讨亚低温的作用机制。1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 动物与分组 12周龄清洁级健康雄性W istar
大鼠72只，质量260～320g，购自山东大学医学院实验动物中心(许可证:SCXK 鲁20030004)。随机分为假手术组和I CH 后6h 、24h 、48h 、72h 、7d 组，每组
再分为常温亚组和亚低温亚组，每个亚组6只。
1.1.2 主要试剂及仪器 兔抗大鼠多克隆I L21β抗体试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；贴敷式HDB201型局部亚低温脑保护仪，哈尔滨海德医疗设备开发有限公司制造;S L24型温度传感器，武汉同济医科大学研制；立体定向仪，美国产ST OE LTI N G CO.620WHE AT LANE型。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 按照王敏忠等[4]的方法制备动物模型。将动物用1%钠40mg/kg腹腔麻醉，备皮后固定在立体定向仪上，头部正中纵形切口，暴露前囟和冠状缝，在冠状缝前0.2mm、中线右侧旁开3mm处用直径1mm的牙钻钻开颅骨，将制作好的穿刺针的针头端垂直插入脑内6mm固定，去除内芯。取尾动脉血，均匀缓慢地注入50μl 自体全血两次。假手术组仅完成同样的手术过程，但不注入自体血。模型制作成功后，亚低温组立即用贴敷式HDB201型局部亚低温脑保护仪实施4h，将手术侧头皮与局部亚低温仪的探头紧密接触，开始设置温度为8℃。采用S L24型温度传感器监测大鼠鼻咽部、鼓膜温度，调整仪器参数维持脑温在(33±0.5)℃，同时监测大鼠的直肠温度和呼吸。亚低温结束后将大鼠置于25℃环境自然复温。I CH组造模成功后不予以，应用保暖或灯光照射的方法保持体温在37℃。
1.2.2 脑组织标本制作 每个亚组大鼠分别于相应时间点用钠深度麻醉后开胸，经左心室插管至升主动脉，生理盐水250m l灌注后，再用4%多聚甲醛溶液(pH7.4)250m l灌注至肝、脾变白发硬；然后迅速断头取脑，以注入点为中心前后各6mm处冠状切除鼠脑额端及枕端，中间部分继续于4%多聚甲醛溶液(pH7.4)中固定24h。以针道为中心其前后2mm各切成一脑片做成蜡块。
1.2.3 HE染及I L21β检测 将石蜡包埋的脑组织块在切片机上连续切片，片厚5μm，靠近血肿的切片作苏木素2伊红(HE)染及免疫组化检测。HE染按照常规方法进行。I L21β检测应用免疫组化检测方法，步骤如下：切片置60～65℃烤箱中50m in，常规脱蜡、水化。然后将3%过氧化氢溶液50m l
加入切片，室温10m in灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗2m in×3次后，浸入0.01mol/L(pH6.0)枸橼酸盐缓冲液中，置微波炉95～98℃热修复15m in，自然冷却至室温,P BS冲洗2m in×3次后滴加正常非免疫动物血清封闭液，室温下20m in后甩去多余液体滴加兔抗大鼠多克隆I L21β一抗(1∶100稀释), 37℃孵育1～2h,P BS冲洗5m in×3次；滴加50m l 二抗,37℃孵育30m in,P BS冲洗5m in×3次，滴加试剂S ABC，室温孵育20m in,P BS冲洗5m in×4次。DAB显约2～5m in，蒸馏水冲洗，苏木素复染5～10m in后于1%盐酸乙醇中分化，再次蒸馏水冲洗后于自来水中返蓝10m in，依次置75%、85%、95%、100%乙醇中1～2m in脱水、透明，中性树胶封片后，在400倍高倍镜下随机取靠近血肿的5个视野，采用阳性细胞计数法，计数I L21β阳性表达细胞数，取平均值。HE染切片在显微镜下观察脑组织病理学改变。
1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。数值以均数±标准差( x±s)表示，两组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 模型制作结果 60只制做I CH模型大鼠中有54只模型制作成功并生存良好,I CH常温组和亚低温组各有3只大鼠因造模不成功被排除。
2.2 各组血肿周围脑组织病理学变化比较 I CH常温各亚组改变：大鼠脑组织在注血后6h血肿内红细
胞形态完好，可见血肿周围少量散在炎细胞浸润。24 h可见神经元数目减少，排列紊乱，神经细胞、胶质细胞轻度肿胀，炎症细胞浸润以单个核细胞为主，部分神经元水肿变性。48h可见血肿周围脑组织高度水肿，液化坏死，以分叶中性粒细胞为主的大量炎症细胞浸润，神经元明显变性坏死，并可见噬神经细胞现象。72h红细胞部分溶解，大量含铁血黄素沉积，炎性细胞数减少，血肿周围及血肿内胶质细胞增生。自体血注入后7d，血肿明显缩小，胶质细胞及血管增生明显，有较多的格子细胞。I CH亚低温各亚组病理学改变：各时间点脑组织水肿明显轻于I CH常温各亚组，神经元变性坏死程度较轻，炎症反应及胶质细胞反应较I CH常温各亚组轻(图1、2)。假手术组大鼠脑组织结构完整，仅针道处有少量的炎细胞浸润。
2.3 各组脑组织I L21β阳性细胞表达的比较 见表1。假手术组仅见散在少量的I L21β阳性细胞表达。与假手术组比较,I CH常温6h亚组I L21β阳性细胞表达已开始增多,48h亚组表达达高峰,7d亚组仍明显高于假手术组(均P<0101)。I L21β阳性细胞表达主要位于血肿周围的神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮细胞、炎症细胞等。I CH6h亚低温亚组I L21β阳性细胞数与相应的I CH常温亚组差异无统计学意义,24h亚组、48h亚组、72h亚组、7d 亚组I L21β阳性细胞数均显著低于相应的I CH常温亚组(均P<0101)。I CH24h常温及亚低温亚组I L21β阳性细胞表达的比较见图3、4。
图1 I CH24h常温亚组神经元变性，较多中性粒细胞和单核细胞浸润，脑组织水肿明显(HE染,×400) 图2 I CH24h亚低温亚组炎症细胞较常温组少，脑组织水肿程度较轻(HE染,×400) 图3 I CH24h常温亚组I L21β阳性细胞表达(免疫组化染,×200) 图4 I CH24h亚低温亚组I L21β阳性细胞表达(免疫组化染,×200)
表1 各组大鼠I CH灶周围脑组织I L21β阳性细胞表达的比较( x±s)
组别 0h6h24h48h72h7d
I CH常温亚组 -8.22±1.58342.53±3.14362.50±5.78359.03±3.67322.73±3.033假手术常温亚组 3.13±1.80-----
I CH亚低温亚组- 6.84±1.74331.21±2.753△41.23±5.383△38.12±3.553△14.24±2.683△假手术亚低温亚组 3.01±1.73-----
注：与假手术常温对照亚组比较3P<0101；与同时间点I CH常温亚组比较△P<0101
3 讨 论
动物及临床研究[527]发现,I CH后血液成分会导致血肿周围出现炎性反应和水肿，这种炎性损伤是I CH
后继发性损害的重要原因之一。局部亚低温可以促进I CH患者的神经功能恢复，改善预后[8]，并可以保护血2脑屏障，减轻脑水肿[9]，但是局部亚低温对I CH的作用机制目前还不甚明了。本实验发现大鼠I CH后经过局部亚低温，炎症反应及神经元变性坏死程度亚低温亚组较常温亚组减轻，脑组织水肿明显轻于I CH常温各亚组。
早年的研究[10212]证实,I L21是一强有力的炎性介质，其中I L21β是中枢神经系统中存在的主要形式，它能够协同其他细胞因子促进B、T细胞增殖和活化，促进白细胞粘附于毛细血管或小血管壁并渗透至脑组织中，引起脑血肿周围的多核白细胞聚集，并可以直接作用于血管内皮细胞影响其通透性而导致脑水肿；而且I L21β能够诱导激活其他炎性介质，诱导黏附分子的合成与释放，并可诱导自由基产生，启动多种细胞因子级联反应。因此I L21β具有初始炎性反应并级联放大炎症过程的作用，诱导免疫活性细胞产生继发性细胞因子及其他炎症介质，最终造成组织器官的损伤。近年动物实验[13,14]显示,I CH时I L21β表达增高，李玮等[15]也发现,I CH急性期患者血清、脑脊液中I L21β水平明显升高，且与病情严重程度有显著的相关性，初步提示I L21β变化与I CH急性期神经细胞损伤有关。W agner等[16]应用亚低温猪I CH模型发现，后血肿周围提取的I L21βRNA水平明显降低，血管性水肿减轻，说明亚低温可减轻血肿灶周的炎性反应和血2脑屏障的破坏程度。
本实验动态观察了大鼠I CH后血肿周围组织中I L21β的表达，发现I CH后6h时I L21β表达轻度增加,48h达到高峰,7d时仍高于假手术组,I L21β的表达强度与组织学上炎性反应程度一致；经局部亚低温
后,I L21β阳性细胞表达水平各时点亚低温组较相应时点常温组明显降低。这一方面说明I L21β的过度表达与I CH后炎性反应有关，另一方面也初步证实了局部亚低温具有减轻大鼠I CH后炎性损伤的价值，值得进一步观察研究。
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(收稿日期2009206201 修回日期2009207212)
・病例报告・
首发锥体外系症状的假性甲状旁腺功能减退症1例报告
梁朝莹，沈岳飞，郑金瓯
【中图分类号】R747.9 【文献标识码】D 【文章编号】100421648(2010)0120037201作者单位:530021南宁，广西医科大学第一附属医院神经内科通讯作者：沈岳飞
首发锥体外系症状的假性甲状旁腺机能减退症(PHP )国内少见报道，现报告1例如下。
1 病例 男,16岁。因“头部和肢体不自主运动7年、加重
伴双下肢僵直9个月”于2009年3月11日入院。患者于
2002年6月开始出现头部不自主摇动及四肢不自主运动，有
时伴四肢抽动，约数分钟至十多分钟出现1次，幅度不大，上课时多见，行走时也有发生，吃饭睡眠时消失。2008年6月始行走久时出现右下肢僵直，足跖屈，足跟不能着地，抬起困难，需划步才能行走，伴有同侧上肢乏力、屈曲、抽动，约20～40
m in 可自行缓解。发作时意识清醒、无二便失禁等现象。以
上症状反复发作，每周2～3次。同年10月左下肢也出现相似症状，但仍以右下肢为甚。患者系第2胎、足月顺产，生长发育较同龄人略滞后，上学期间学习成绩差，运动能力落后于同龄人。查体：身高136c m，体质量28kg 。胸廓可见肋骨呈串珠样改变。双手指短，第5指畸形，双足趾短不对称，第3、4趾并趾畸形。心、肺、腹均未发现异常。神经系统检查：可见不自主眨眼、嘴角抽动、向左侧转头及四肢不自主屈伸，伴偶发一过性抽动，四肢肌张力高，呈铅管样，肌力5级。双侧腱反射对称，踝反射(7)，病理反射(-)，共济运动未见异常。实验室检查：血尿便常规及肝肾功能均正常。两次血钙分别为1.5mmol/L 、1.52mmol/L，磷3.26mmol/L，尿钙0.22
mmol/24h (正常值2.50～7.50mmol/24h )，血甲状旁腺激素(PTH )276.3pg/m l (正常值6～90pg/m l )。韦氏智力量表：言
语智商(V I Q )75分，操作智商(P I Q )47分，语言：模仿量表值
差>15分。心电图检查正常。胸部后前位X 线片检查示心肺膈正常。头颅CT 扫描：两侧大脑皮质、基底节(苍白球明显)、小脑半球多发钙化灶。：经口服氟醇、补钙等后上述症状有所缓解，于2009年3月24日出院。
上海健身房阉割2 讨论 PHP 是一种罕见的家族遗传性疾病，由于PTH 受
体和(或)受体后信号传导(第二信使c AM P )缺陷，使靶器官
(骨和肾)对PTH 抵抗，出现低钙、高磷、高PT H 血症及多种
先天性生长和骨骼发育缺陷。尽管部分患者临床上难以和原发性甲状旁腺功能减退区别，但通过测定PTH 增高则可肯定诊断。PHP 由于受累的靶器官不同，临床表现多种多样，但其共同特征为：有甲状旁腺功能减退症的特征(低血钙、高血磷，尿钙、尿磷降低，手足搐搦等)，血清PT H 高于正常，靶组织对生物活性PTH 无反应，常伴有先天性发育畸形，可有智力减退并呈特殊体态如身材粗矮、肥胖、圆脸、颈粗短、指
(趾)短小畸形，常见第一、四、五掌骨或跖骨缩短(AHO 畸
形)。颅脑CT 扫描可见脑内钙化灶，尤以基底节为著，双侧尾状核头部、体部和豆状核对称性钙化，呈倒“八”字形、新月形和蝴蝶形改变，而内囊正常；丘脑为对称性卵圆形钙化，小脑齿状核为对称性
圆弧状和斑片状钙化，皮、髓质交界区为对称性条索状或斑片状钙化，而皮质正常。
本例患者以不自主运动为首发症状，具有低血钙、高血磷、血清PTH 升高、尿钙变化的特点。同时伴有特殊体态，结合颅脑CT 双侧基底节钙化为著的特征，临床上符合PHP 。因目前只能对症处理，主要以终生补钙。本例经口服氟醇及补钙等后症状有所缓解。
(收稿日期2009205206 修回日期2009208217)
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