(19)中华人民共和国国家知识产权局
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(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711478873.3
(22)申请日 2017.12.29
(71)申请人 国家卫生计生委科学技术研究所液碱
地址 100081 北京市海淀区大慧寺路12号
(72)发明人 马旭 高建恩 郭昌龙
(74)专利代理机构 北京三聚阳光知识产权代理
有限公司 11250
代理人 李静
(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
C12N 5/0784(2010.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种免疫细胞培养基、培养方
法以及用途，免疫细胞培养基包括基础细胞培养
基、细胞因子和糖皮质激素；免疫细胞培养方法
包括以下步骤，S1、采集待培养的免疫细胞并激
活；S2、将激活的免疫细胞接种上述免疫细胞培
养基中进行细胞培养；S3、收获免疫细胞。细胞培
养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子；细胞
因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。本
发明提供的免疫细胞培养基和培养方法能够有
效地增加培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例。权利要求书1页 说明书13页 附图3页CN 108251369 A 2018.07.06
C N 108251369
A
1.一种免疫细胞培养基，其特征在于，包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种；
优选的，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述免疫细胞培养基中所述糖皮质激素的含量为0.6-1.2μg/mL；优选的，所述糖皮质激素的浓度为0.8μg/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子选自白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述免疫细胞培养基中所述细胞因子的含量为50-4000U/mL；优选的，所述细胞因子含量为1000U/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述免疫细胞培养基中还包括维生素。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述维生素选自维生素B3。
8.根据权利要求6或7所述的免疫细胞培养基，其特征在于，所述免疫细胞培养基中所述维生素的含量为2-6μg/mL；优选的，所述维生素的含量为4μg/mL。
9.一种培养免疫细胞的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-8任一项所述的免疫细胞培养基的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采集待培养的免疫细胞并激活；
S2、将激活的所述免疫细胞接种至权利要求1-8任一项所述的免疫细胞培养基中进行细胞培养；
S3、收获所述免疫细胞。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，在S1步骤中，使用细胞培养刺激液激活所述免疫细胞，所述细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子包括白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子中包括白介素2、白介素15和白介素21，所述白介素2含量为50U/mL -4000U/mL，所述白介素15含量为5ng/mL -100ng/mL，所述白介素21含量为1ng/mL -50ng/mL；优选的，所述白介素2的浓度为500U/mL，所述白介素15浓度为20ng/mL，所述白介素21浓度为5ng/mL。
14.权利要求1-8任一项所述的免疫细胞培养基或权利要求9-13任一项所述的培养免疫细胞的方法在培养免疫细胞中的用途。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、DC细胞、LAK细胞或CIK细胞。
16.根据权利要求14或15所述的用途，其特征在于，所述免疫细胞为CD8+CD56+CD3-的NK细胞。
权 利 要 求 书1/1页CN 108251369 A
一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途
技术领域
[0001]本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途。
背景技术
[0002]自然杀伤性细胞(natural killer cell，NK)是机体免疫细胞中非常重要的先天性免疫细胞，是机体抵抗病毒入侵、清除癌变和老化细胞的重要效应细胞，被称作是机体抗病毒、抗肿瘤的第一道屏障。NK细胞发现于上世纪70年代，近40年来随着对NK细胞的研究的不断深入，确定了NK细胞为一以细胞表面标志物CD56+CD16+CD3-的异质性细胞。研究表明，与T细胞、B细胞相比，NK细胞表面标志物的特异性是相对的。人NK细胞mIg-，部分NK细胞CD2、CD3和CD8阳性，表达IL-2受体β链(P75,C
D122)，CD11b/CD18阳性。常用检测NK细胞的表面标志物有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。NK细胞可以根据其细胞表面标志的不同分成许多细胞亚，不同细胞亚具有不同的生物学功能。
[0003]CD8分子是细胞表面表达的糖蛋白分子，是常用的细胞分类的表面标志物之一，完整的CD8分子由α和β两种分子组成，主要存在于T细胞表面，在流式细胞检测中表现为强阳性，是在体内杀伤肿瘤和病毒感染细胞方面非常重要的效应T细胞。这类细胞的免疫学表型为CD8+CD3+(CD8阳性的T细胞)。
[0004]NK细胞区别于T细胞的一个重要特征为NK细胞表面标志物CD3大多为阴性，而所有T细胞的表面标志物CD3均为阳性。NK细胞在健康人外周血淋巴细胞(PBMC)中所占比例为10％-15％左右，其中有一个细胞亚在流式细胞检测中表现为CD8弱阳性，约占NK细胞的30％-40％左右，占外周血淋巴细胞(PBMC)的3％左右。Edward等人在1990年观察到这一细胞亚在体外的肿瘤杀伤实验中表现出了较CD8阴性的NK细胞具有更强的杀伤活性。随后的研究相继发现这一细胞亚不仅具有较强的肿瘤细胞杀伤活性，同时在慢性病毒感染的病人中如HIV感染者中，这一细胞亚的数量与功能都明显下降，显示这一细胞亚不仅在机体抗肿瘤方面，而且在抗病毒方面可能具有重要的作用。2005年Addison等人研究发现，CD8阳性的NK细胞通过其表面的CD8α分子之间的相互交联，可以有效的抵抗由于激活所造成的NK细胞凋亡，同时可以提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。
[0005]鉴于NK细胞具有的肿瘤杀伤作用，多年来NK细胞一直是过继性免疫细胞的重要的效应细胞之一。2012年以来NK细胞的体外培养与扩增一直是NK细胞免疫细胞技术研究领域的重要课题，相继建立了NK细胞的体外扩增与培养的方法。但有关CD8阳性的NK细胞的体外培养与扩增的方法，目前尚未见报道，现有的体外扩增方法通常是对整体的NK细胞进行体外培养和扩增，并不能保证其中的CD8阳性的NK细胞亚能够得到大量的扩增，如中国专利文献CN105754941A公开的一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，通过应用细胞因子白介素-2、白介素-15、4-1BBL和SCGM培养基联合培养外周血单个核细胞，前期使用自体血清和白介素-2以及白介素-15、4-1BBL孵育固定在细胞培养板上诱导激活单个核细胞中的少量NK细胞快速增殖，后期采用含有自体血清的SCGM培养基以及白介素-2、白介素-15、4-1BBL培养细胞诱导NK细胞大量快速增殖。上述方案获得了一定数量和活力的NK细
胞，能够对肿瘤细胞起到杀伤作用。然而上述方案仅能扩增NK细胞，并没有针对其中的CD8阳性的NK细胞亚进行培养和扩增而设计相应的培养基和方法步骤，因此上述方案无法保证对NK细胞扩增的同时对其中的CD8阳性的NK细胞亚进行扩增，即上述方法无法在体外扩增和培养出大量的CD8阳性的NK细胞。
发明内容
[0006]因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中无法在体外稳定扩增和培养出大量的CD8阳性的NK细胞，进而提供一种能够在体外稳定扩增培养出大量的CD8阳性的NK细胞的免疫细胞培养基、培养方法以及用途。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0008]本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素。
[0009]优选的，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种，优选的，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠。
[0010]优选的，所述免疫细胞培养基中所述糖皮质激素的含量为0.6-1.2μg/mL；优选的，所述糖皮质激素的浓度为0.8μg/mL。
[0011]优选的，所述细胞因子选自白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。[0012]优选的，所述免疫细胞培养基中所述细胞因子的含量为50-4000U/mL；优选的，所述细胞因子含量为1000U/mL。
漯河市商业银行[0013]优选的，所述免疫细胞培养基中还包括维生素。
[0014]优选的，所述维生素选自维生素B3。
[0015]优选的，所述免疫细胞培养基中所述维生素的含量为2-6μg/mL；优选的，所述维生素的含量为4μg/mL。
[0016]本发明提供一种培养免疫细胞的方法，包括使用所述的免疫细胞培养基的步骤。[0017]本发明提供一种培养免疫细胞的方法，包括如下步骤：
[0018]S1、采集待培养的免疫细胞并激活；
[0019]S2、将激活的所述免疫细胞接种至所述的免疫细胞培养基中进行细胞培养；[0020]S3、收获所述免疫细胞。
[0021]优选的，在S1步骤中，使用细胞培养刺激液激活所述免疫细胞，所述细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子。
阿普尔
[0022]优选的，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。
[0023]优选的，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子中包括白介素2、白介素15和白介素21，所述白介素2含量为50U/mL-4000U/mL，所述白介素15含量为5ng/mL-100ng/mL，所述白介素21含量为1ng/mL-50ng/mL；优选的，所述白介素2的浓度为500U/mL，所述白介素15浓度为20ng/mL，所述白介素21浓度为5ng/mL。
[0024]本发明提供一种利用所述的免疫细胞培养基或所述的培养免疫细胞的方法在培养免疫细胞中的用途。
扣B标准手势[0025]优选的，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、DC细胞、LAK细胞或CIK细胞。
[0026]优选的，所述免疫细胞为CD8+CD56+CD3-的NK细胞。
[0027]本发明技术方案具有如下优点：
[0028] 1.本发明提供的免疫细胞培养基，包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素，通过细胞因子和糖皮质激素的协同作用下，有效的提高培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例，实现在体外扩增培养出大量的CD8阳性的NK细胞的目的。
[0029] 2.本发明提供的免疫细胞培养基，糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种；细胞因子选自白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。细胞因子能够有效的诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟，本发明使用白介素2、白介素15和白介素21的组合可以有效的提高培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例；特别是添加的白介素21增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，在临床上，糖皮质激素如地塞米松、可的松等是作为抗过敏药物使用，其基本功能是免疫抑制作用，但在低剂量
使用时可以与白介素15协同作用，有助于NK细胞的体外增殖，同时也会降低白介素15引发的NK细胞的死亡。
[0030] 3.本发明提供的免疫细胞培养基，添加了维生素B3，有助于提高NK细胞(CD56+ CD3-)在扩增细胞中的比例。
[0031] 4.本发明提供的培养免疫细胞的方法，包括如下步骤：S1、采集待培养的免疫细胞并激活；S2、将激活的免疫细胞接种至本发明提供的免疫细胞培养基中进行细胞培养；S3、收获免疫细胞；其中细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子，细胞培养刺激液中细胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。使用该方法培养的CD8+NK细胞(CD56+CD8 +CD3-)在扩增培养后的比例可以达到38％，可以使CD8阳性的NK细胞随着NK细胞总数的增加而增加。
[0032] 5.本发明提供的免疫细胞培养基及培养方法，使用不同的基础培养基对于CD8+NK 细胞的扩增培养的比例没有影响，可以适配更多不同的基础培养基。
附图说明
[0033]图1为本发明实施例1中体外扩增后的CD8+NK细胞的流式分析结果：其中图A为SCC vs FSC，图中线段圈出的部分选取的活细胞进行分析，图B为在图A中选取的活细胞的基础上选取CD3+细胞(图
中框内)；图C为CD56+细胞中有一部分细胞为CD8+(右上象限)，包括一部分CD3+的NKT细胞和NK细胞；图D显示的是CD8+NK细胞在NK细胞中所占比例为38％(左上象限)；
[0034]图2为本发明实施例2中8例健康人PBMC分别使用实施例1中的免疫细胞培养基和无糖皮质激素的免疫细胞培养基进行体外培养后的CD8+NK细胞的含量比较结果图；[0035]图3为本发明实施例2中8例健康人PBMC和实施例3中3例脐血PBMC分别使用实施例1中的免疫细胞培养基及培养方法进行体外培养后的CD8+NK细胞的含量比例比较结果图。[0036]图4为本发明实施例6中使用不同基础培养基体外扩增后的CD8+NK细胞的流式分析结果图。
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