吴方毅;任妮丽
【摘 要】目的：：检测TNF-α与IL-17在银屑病皮损中的表达。方法： ELISA检测68例银屑病患者与28例对照(非银屑病患者)血清TNF-α和IL-17的表达；免疫印迹法检测局部皮损、患者正常皮肤及对照者皮肤中TNF-α和IL-17的表达；qT-PCR检测TNF-α和IL-17的mRNA表达。结果：银屑病患者血清TNF-α、IL-17的表达均高于对照组( P<0.05)；皮损组织中TNF-α、IL-17蛋白及mRNA的表达均高于患者正常皮肤及对照组皮肤(均P<0.05)。结论： TNF-α与IL-17在银屑病的发展中可能相互作用。%Objective:To detect the expression of TNF-αand IL-17 in the patients with psoriasis. Meth-ods:The serum levels of TNF-α and IL-17 were detected in 68 patients with psoriasis and 28 controls from cosmetic surgery department. The expression of protein TNF-αand IL-17 in the patients’ lesions and normal skin of the patients as well as the skin of normal controls was detected by ELISA and the mRNA of TNF-αand IL-17 was detected by qT-PCR. Results:The levels of serum TNF-αand IL-17 were higher in the patients than in controls. The levels of protein and mRNA expression of T NF-αand IL-17 were higher in the patients’ lesions than in the normal skin of the patients and controls. Conclusion:TNF-αand IL-17 may be interacted in the progress of psoriasis.
【期刊名称】《中国麻风皮肤病杂志》
【年(卷),期】2015(000)009
【总页数】4页(P551-554)avr单片机最小系统
【关键词】TNF-α;IL-17;银屑病
【作 者】吴方毅;任妮丽
【作者单位】湖北医药学院附属人民医院皮肤科，十堰，442000;湖北医药学院附属人民医院医务科，442000
城市街道办事处组织条例
还俗方丈【正文语种】中 文
银屑病的发病率约1～5%，1，2银屑病的病因还不完全清楚，普遍认为是一种自身免疫性
股权交易的炎性疾病。银屑病的全基因组关联已经确定，这些关联的基因位点参与了皮肤的屏障功能（LCE3A，LCE3C和LCE3D）、T-细胞信号转导（IL-2，IL-17，IL-21，IL-13，IL-12B，IL-23A，IL-23R等）和抗原提呈（ERAP1和HLA-C）。3，4在这些因子中，细胞因子白介素-17在银屑病的发病机制中具有至关重要的作用。银屑病斑块显示活化的T细胞，特别是Th17型的浸润放大了炎性反应，活化的T细胞分泌的重要细胞因子包括IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-17，肿瘤坏死因子（TNF）-α，干扰素γ，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子和血小板介导的生长因子。5TNF-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，在异常情况下，特别是其水平升高时会导致免疫病理反应，如类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病、炎性肠炎、克朗病等。新近研究发现，6银屑病患者皮损、血清、关节腔滑膜或细胞培养上清液中TNF-α的水平较正常对照组明显升高，经后会有不同程度的下降，且银屑病患者病情严重程度与TNF-α的水平呈正相关，提示TNF-α在银屑病发病机制中有重要作用。IL-17和TNF-α的组合表现出复杂的相互作用与增强基质的形成，7碱性磷酸酶活性，并具有降低Schnurri-3表达的净效应。但两者在银屑病中的共表达及意义尚无相关研究。本文主要研究IL-17与TNF-α在银屑病中的共表达及意义。
1.1 材料
1.1.1 试剂 TNF-α抗体购自于 saierbio（货号：ReSRP00068），IL-17抗体购自于 BD（货号：559501），IL-17A ELISA试剂盒购自于Enzo（货号：ADI-900-177），TNF-αELISA试剂盒购自于Diaclone（货号：950.090.048）华中理工大学出版社
1.1.2 标本 收集我科2000-2013年经病理证实为银屑病的患者资料68例，其中男31例，女37例，年龄20～75岁，平均38岁，收集外周静脉血液标本，及背部或腹部破损的皮损组织（A组），取距皮损处大于12 cm的正常皮肤送检作对照（B组）。同期我院整形美容科门诊28例患者废弃的正常皮肤作为正常皮肤对照（C组）。收集的皮肤做液氮冷冻保存。收集的银屑病患者外周血液离心后取血清冷冻保存，同期体检门诊健康人血常规血清液做健康对照。所有病例均有患者签字的知情同意书和有创操作同意书。
1.2 方法
1.2.1 运用ELISA检测循环血中TNF-α/IL-17的表达水平，采用人血清TNF-αELISA试剂盒以及人血清IL-17 ELISA试剂盒，450 nm紫外线下检测，8各种实验要求和步骤严格按照说明书进行，计算各样本TNF-α/IL-17蛋白数值乘以稀释倍数，取得TNF-α/ IL-17蛋白的血浆浓度。
1.2.2 Western检测银屑病患者局部皮损组织、皮旁组织及正常皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达将皮肤组织收集到的匀浆液进行免疫印记法9检测。TNF-α/IL-17抗稀释度分别为1∶400、1∶600。图像分析系统扫描分析各条带灰度值，结果取被检条带与内参条带的灰度值之比。
1.2.3 运用qT-PCR检测银屑病患者局部皮损组织、皮旁组织及对照皮肤组织中TNF-α/IL-17的mRNA表达水平，剪绿豆大皮损样品，加入1 mL Trizol，匀浆器匀浆。加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温放置5 min，12 000 rpm 15 min 4℃。转上层水相（约400μL）于新1.5 mL EP管中，加入400μL异丙醇，混匀，室温静置10 min，12 000 rpm 10min 4℃。弃上清，沉淀用预冷的70%无水乙醇洗3次，空气干燥5～10 min，溶于20μL DEPC水中。分光光度计测定RNA浓度。将所得到的cDNA做10倍稀释，取4μL进行逆转录，10Green/Flouresceinq PCR Master Mix（2X）10μL，H2O 5.2μL；DL2000：2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；Cycling conditions，40 cycles of 95℃-30 s，60℃-30 s。引物设计见表1：
1.2.4 统计学方法 统计学分析采用SPSS 19.0软件。使用卡方检验分析TNF-α和IL-17在银
屑病患者及对照组中表达的差异。银屑病患者血液及皮损组织中TNF-α和IL-17之间进行表达相关性分析。P＜0.05为差异有显著性统计学意义。
2.1 银屑病患者与健康人循环血中TNF-α/IL-17表达水平的比较 采用ELISA试剂盒检测银屑病患者与健康人循环血中TNF-α/IL-17表达，发现TNF-α/IL-17在银屑病患者血液中的表达均高于健康人（表2，图1），表明TNF-α/IL-17在银屑病患者血液中存在共同高表达现象。
2.2 局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达 运用Western-blot检测局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/ IL-17表达，发现TNF-α/IL-17蛋白水平在皮损组织中显著高于皮损旁组织及健康皮肤组织（均P＜0.05），对照组与皮旁组织无统计学意义。表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基础，在银屑病中炎症因子与TNF-α可能存在协同促进作用，见图2。
2.3 局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17 mRNA的表达 为了在mRNA水平进一步研究局部皮损组织、皮损旁组织及健康皮肤组织中的TNF-α/IL-17表达，我们所取得的标本做TNF-α/IL-17的FQ-PCR分析。FQ-PCR结果发现TNF-α/IL-17分别在其
局部皮损组织显著高于对照组和皮损旁组织（P＜0.05），对照组与皮旁组织无统计学意义。这些表达趋势与蛋白水平相一致，进一步表明TNF-α/IL-17存在相互作用的分子基础，见图3。
白细胞介素-17（IL-17A）属于六配位成员（IL-17A和IL-17F）促炎细胞因子，IL-17是该系列的原型。这种二聚体糖蛋白在循环中存在同型二聚体IL -17A或异源二聚体IL-17F。11-13在银屑病的发病机制研究中，无论是先天还是后天性免疫系统中所涉及的银屑病，过度增殖角质形成细胞是通过从T细胞的细胞因子驱动的，产生进一步的促炎性细胞因子。银屑病斑块显示活化的T细胞，特别是Th17细胞的浸润放大炎性反应，产生大量的IFN-γ，IL-17，IL-22和TNF-α。这显示出IL-17和TNF-α均在银屑病中具有重要作用。
在本实验中发现，银屑病患者循环血液中IL-17和TNF-α均高于对照组，并且在蛋白水平和mRNA水平同样显示出局部皮损组织中均高于皮旁组织及正常皮肤组织，说明IL-17和TNF-α在银屑病患者有显著高表达现象。一个更加关键的报道是14TNF-α抑制BMP2表达时增强了IL-17的分泌。TNF-α与IL-17共同激活NF-κB和AP-1，15，16IL-17上的hMSCs增加TNF-α的作用效率，14为此我们推测在银屑病中可能也存在这种交叉反应。
3500年前情侣墓初步实验中我们发现IL-17和TNF-α在银屑病中均显著高表达，这表明两信号通路存在相互作用的分子基础。为了进一步研究IL-17和TNF-α在银屑病中是否具有相互作用，我们对比银屑病患者循环血液中IL-17和TNF-α的表达，并进行相关性分析，发现两者的表达具有相关性。在后续的免疫印迹实验和qT-PCR实验中也发现IL-17和TNF-α在银屑病患者皮损组织中的表达具有相关性，并且在局部皮损组织、皮旁组织及对照皮肤组织中表现出明显的梯度趋势。这些结果表明IL-17和TNF-α在银屑病进展中可能存在相互作用。
综上所述，本文初步探讨了银屑病患者循环血液及局部皮损组织中TNF-α/IL-17的表达，发现TNF-α/IL-17在银屑病患者显著高表达，且两者具有共表达趋势；TNF-α/IL-17在银屑病的进展中可能存在相互作用。由于本文只是初步探讨TNF-α/IL-17的表达，为研究两者在银屑病中相互作用的分子基础提供理论依据，尽管结果表明TNF-α/IL-17两信号通路可能存在相互作用，但是还不足以证实，这有待于下一步的深入研究，其结果可能为银屑病的多靶点联合提供新的选择。
·病例报告·
【相关文献】
1Christophers E.Psoriasis--epidemiology and clinical spectrum. Clin Exp Dermatol，2001，26（4）：314-320.
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