重组人白介素-18基因工程菌的构建实验预习试题库
一、填空题
1、目的基因产物和质粒载体酶切是使用的同尾酶是（ ）和（ ），反应温度是（ ）℃，实验中的反应时间是（ ）hr。
2、两个双酶切产生的DNA片段连接时使用的酶为（ ），连接反应的温度是（ ）。
电梯门机控制器3、感受态细胞的制备时细菌OD600大约为（ ），处于（ ）生长期。 4、感受态细胞的制备时，热击的温度是（ ），原因是（ ）；感受态细胞转化时，感受外源DNA的温度是（ ）℃，目的是（ ）。
5、PCR扩增目的基因片段共分3步，分别是（ ）、（ ）和（ ）。
6、质粒DNA的三种存在方式是（ ）、（ ）和（ ），它们在琼脂糖凝胶电泳时的迁移率由大到小的顺序是（ ）。 7、用M13 Primer M4和M13 Primer RV为引物进行重组质粒的阳性鉴定时，含重组质粒的阳性克隆PCR
产物大小为（ ）bp，含pUC18自连产物的假阳性克隆PCR产物大小为（）bp，若PCR反应后电泳没有任何条带说明（ ）或（ ）。
8、DNA分子结构外侧（ ）带（ ）电荷，琼脂糖凝胶电泳时DNA样品时应把置于电泳槽的（ ）极；电泳时为获得最好分辨率，电压最大不超过（ ）V/cm。
9、在连接产物转化时，Amp的作用是（ ），X-gal的作用是（ ），IPTG的作用是（）。感受态细胞的转化效率用（ ）评价。
10、用M13 Primer M4和M13 Primer RV为引物进行重组质粒的阳性鉴定时，若PCR产物大小为100 bp，则说明该质粒是（ ），若PCR产物大小为600 bp，则说明该质粒是（），若PCR反应后电泳没有任何条带说明（ ）或（ ）。
11、从原理上讲，蓝白斑筛选时的白斑是含（ ），兰斑是含（ ）。
12、两个双酶切产生的DNA片段连接时使用的酶为（ ），连接反应的温度是（ ）。
13、蓝白斑筛选时的X-gal的作用是（ ），IPTG的作用是（ ）
14、碱裂解法制备质粒DNA共分3步，分别是（ ）、（ ）和（ ）。
15、琼脂糖凝胶电泳时应把DNA样品置于电泳槽的（ ）极，电泳时为获得最好分辨率，电压最大不超过（ ）V/cm，电泳缓冲液中的（ ）能够指示电泳前沿。
16、两个双酶切产生的DNA片段是（ ）末端，连接时使用的酶为（ ），连接反应的
温度是（ ）。
17、PCR是（ ）的缩写，一般分为（ ）三步。
18、PCR反应中用于扩增DNA的酶为（ ），引物在反应中所起的作用是（ ），用于扩增DNA的底物是（ ）。
参考答案：
1、BamHI； BglII； 37； 3
2、T4DNA连接酶； 16 ℃或4 ℃
3、0.4； 对数
4、42； 促进细胞吸收DNA复合物； 37； 细胞复原并分裂增殖
5、变性； 退火； 延伸
6、超螺旋； 线性； 开链环状； 超螺旋>线性>开链环状
7、600； 100； PCR反应失败； 琼脂糖电泳失败
8、磷酸骨架； 负； 阴； 5
李健吾9、选择性筛选标记； β-半乳糖苷酶的反应底物； β-半乳糖苷酶表达的诱导剂； 转化子总数／感受态细胞总数
10、载体自连产物； 带有目的基因的重组质粒； PCR反应没成功； 琼脂糖电泳有问题
11、目的基因的重组子转化产物； 质粒自连产物的转化产物
12、T4 DNA连接酶； 16 ℃或4 ℃
13、β-半乳糖苷酶的反应底物； β-半乳糖苷酶表达的诱导剂
14、变性； 退火； 延伸
15、阴； 5； 溴酚蓝
16、粘性； T4 DNA连接酶； 16 ℃或4 ℃
17、polymerase chain reaction； 变性，退火，延伸
18、Taq DNA聚合酶； 形成引物-模板复合物并沿着引物延伸 ； 模板
二、简答题
1、简述核酸电泳的过程以及注意事项。（5分）
2、在感受态细胞的转化实验中要加入何种对照来解释实验结果？（7分）
3、简述碱裂解法小量提取质粒DNA的主要步骤。（8分）
4、简述PCR反应的过程。（7分）
5、简述琼脂糖凝胶制备时的主要过程和需要注意问题。（8分）
6、简述DNA琼脂糖凝胶回收的主要操作过程和注意事项。（7分）
7、简述DNA连接酶在本实验中的用途以及常用的反应条件。（4分）
8、我们学过的检测核酸分子量和存在形态的方法是什么？简述其主要过程和需要注意问题。（8分）
9、在平板中加入的Amp、X－gal和IPTG的作用是什么？（5分）
10、感受态细胞的转化效率是如何评价的？（5分）
11、简述PCR反应的过程。（7分）
12、在感受态细胞的转化实验中要加入何种对照来解释实验结果？（5分）
13、简述PCR反应体系的组成、加入顺序和主要注意问题。（8分）
14、简述碱裂解法小量提取质粒DNA的主要步骤。（6分）
15、如何检测核酸分子量和存在形态，简述其主要流程和注意事项。（8分）
blast2go16、简述CaCl2法制备感受态细胞的过程及注意的问题？（6分）
17、简述蓝白斑筛选的基本原理？（10分）
18、PCR的中文全称是什么？简述PCR反应体系的组成、加入顺序和主要注意问题。（8分）集成供应链管理系统
19、常用的感受态细胞的制备方法有哪些？介绍我们在实验中使用的感受态细胞制备过程及注意的问题。（8分）
参考答案：
1、主要过程：制备琼脂糖凝胶，电泳加样，进行琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝前沿至胶长约2/3处停止电泳，照相保存。注意问题：琼脂糖溶解时要使用相应的缓冲液，加热煮沸的火候；插梳子时要避免气泡的产生；加样时样品在阴极；电压不大于5 V/cm。
2、阳性对照pUC18评价感受态细胞的转化效率；阴性对照无菌水评价氨苄抗生素是否失活；空菌对照无菌水（无氨苄抗性）评价大肠杆菌正常。
3、细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。
4、模板DNA变性；引物退火形成引物-模板复合物；引物沿着模板由5’-3’端扩增。
5、主要过程：制胶平板调水平；根据琼脂糖凝胶浓度称取琼脂糖，并用TAE缓冲液溶解，加热煮沸，冷却至50-60℃加入核酸染料，倒胶，插梳子；胶凝固；注意问题：琼脂糖溶解时要使用相应的缓冲液；加热煮沸的火候；插梳子时要避免气泡的产生。
6、主要操作过程：切胶，溶胶，DNA吸附、纯化和洗脱；注意事项：切胶要尽量小，溶
胶要完全，洗脱时可以通过提高温度和洗脱次数增加回收效率。
7、用途：连接5’磷酸末端和3’羟基末端重新形成磷酸二酯键。反应条件：16℃2 h或4℃过夜。
8、采用琼脂糖凝胶电泳法检测，主要过程：制备琼脂糖凝胶，电泳加样，进行琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝前沿至凝胶前沿约1cm处停止电泳，照相保存。注意问题：琼脂糖溶解时要使用相应的缓冲液，加热煮沸的火候；插梳子时要避免气泡的产生；加样时样品在阴极；电压不大于5 V/cm。
9、Amp的作用是选择性筛选标记，X-gal的作用是β-半乳糖苷酶的反应底物，IPTG的作用是β-半乳糖苷酶表达的诱导剂。
10、感受态细胞的转化效率用阳性对照转化子总数／感受态细胞总数评价。
11、模板DNA变性；引物退火形成引物-模板复合物；引物沿着模板由5’-3’端扩增。
12、阳性对照pUC18评价感受态细胞的转化效率；阴性对照无菌水评价氨苄抗生素是否失活；空菌对照无菌水（无氨苄抗性）评价大肠杆菌正常。
巴黎气候协定13、组成：模板，一对引物，dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶及缓冲液，加入顺序，先加水，最后加酶；注意问题，加酶之前要充分混匀。
14、细菌的收获和裂解；质粒DNA的提取；质粒DNA的纯化。
15、采用琼脂糖凝胶电泳法检测，主要过程：制备琼脂糖凝胶，电泳加样，进行琼脂糖凝胶电泳，溴酚蓝前沿至胶长约2/3处停止电泳，照相保存。注意问题：琼脂糖溶解时要使用相应的缓冲液，加热煮沸的火候；插梳子时要避免气泡的产生；加样时样品在阴极；电压不大于5 V/cm。
16、过程：细菌培养物至对数生长期，冷却至0度，离心收集菌体；加入0度CaCl2溶液重悬菌体，冰上放置冷却，离心收集菌体，用CaCl2溶液重悬菌体并分装感受态细胞。
注意问题：无菌操作；操做要轻柔。
17、β—半乳糖苷酶基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。
lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰；外
源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白。
18、聚合酶链式反应；组成：模板，一对引物，dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶及缓冲液，加入顺序，先加水，最后加酶；注意问题，加酶之前要充分混匀。
度盘19、CaCl2法，电激法，聚乙二醇介导的原生质体转化，原生质体融合，细胞核的显微注射，颗粒轰击技术等。
过程：细菌培养物至对数生长期，冷却至0度，离心收集菌体；加入0度CaCl2溶液重悬菌体，冰上放置冷却，离心收集菌体，用CaCl2溶液重悬菌体并分装感受态细胞。
注意问题：无菌操作；操做要轻柔。
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