第38卷第丨2期2020年1 2月
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
中 华中医 药学刊
Vol.38 No. 12Dec. 2 0 2 0
1)()I ：10. 13193/j. issn. 1673-7717.2020. 12.009
胡静1 ’2，刘想忠3，石正帅2，蔡寒涛4，宁宇4，李章华3
[1.华中科技大学同济医学院附W 武汉儿童医院，湖北武汉4300I 5;2.武汉体育学院研究生院，湖北武汉430079;3.武汉大学同仁医院（武汉市第三医院），湖北武汉430074:4.湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北武汉430060]
摘要：目的观察不同浓度柚皮苷（naingin ,NG )对白介素-i p (interleU kin - l p ，IL - i p )诱导的兔关节
软骨细
胞炎性反应的影响，探讨NG 骨关节炎的潜力方法体外正常培养的兔关节软骨细胞用丨L -l p 进行炎性 诱导，造软骨关节炎细胞模型用荧光倒置显微镜观察及吖啶橙、甲笨胺蓝染鉴定软骨细胞，运用CCK -8检 测细胞活性来筛选NG 浓度；取第2代生长良好的软骨细胞，根据所加培养物的不同将实验分为5组：空白组 (C )、模型组（M )、观察组（0H 、0、,、0L )，连续干预72 h ，于和蛋白提取前24 h 加入丨L - i p 通过<]RT-PCR 和Western Blot 检测蛋白聚糖（Aggrecan )、II 型胶原（CoL - II )、基质金属蛋白酶-丨3( MMP - 13)和S 0X 9的表 达结果①吖啶橙及甲苯胺蓝染结果呈阳性，体外分离培养的确为软骨细胞.②CCK -8表明，NG 浓度在大 于10—5mol /L 和小于l 〇-9m oI /L 时，细胞活性较空白组减弱（尸<0. 05) ,NG 浓度在l (T 6mol /L 到KT 8m oI /L 时, 细胞活性增强（f <0.05,P <0.0l )。③qRT -PCR 显示：与空白组相比，模型组&)L -丨丨、Aggrecan 和S 0X 9表达 量显著降低（P <0.05,P <0.01) ,MMP -13表达量升高（P <0.05)；与模型组比，CoL - II 、S 0X 9和Aggrecan 明显 升高（尸<0.05,/><0.0丨），1\1\11:>-13表达量显著降低（尸<0.05,/><0.01) ④Western Blot 显示，与正常组比，模型组C (，L - I I 、S 0X 9和Aggreran 表达量均显著降低（P <0. 05,P <0. 0丨），MMP - 13表达量升高（f ><0.05)；与模 型组比，NG 不同浓度的C 〇L - U 、S 0X 9和Aggr «.a n 表达量均上升；MMP -13下降，且有浓度依赖趋势结论柚 皮苷可以调节软骨细胞基质和炎性微环境，促进软骨细胞CoL - I I 、S 0X 9、Aggr «、a n 的表达，并抑制M M 丨>-13，进 而逆转丨丨.-1P 诱导的软骨细胞炎性退变. 关键词：柚皮苷；骨关节炎；白介素-l p ；软骨细胞中图分类号：R 285.5 文献标志码：A
文章编号：1673-7717(2020)12>0038-07
Regulatory Effect of Icariin on Interleukin - 1 (3 - induced Inflammatory Response
in Rabbit Articular Chondrocytes
H U Jing1'", L IU Xiangzhong', S H I Zhengshuai", C A I Hanlao4 , N I N G Y u J , LI Z h a n g h u a 3
(1. W u h a n Childrens Hospital, Tongji Medical College, H u a z h o n g L niversity of Science & Technolog), W u h a n 430015 ,H u b e i ,C h i n a ；
2. W u h a n Sports University (waduale School, W u h a n 430079 , Hul)ei,C h i n a ；
3. W u h a n University Tongren Hospital( W u h a n Third Hospital) , W u h a n 430074 , H u b e i ,C h i n a ；
h90004. College of Acupuncture and Moxibustion , Hubei University of Traditional Chinese Medicine, W u h a n 430060 , H u b e i ,China)
Abstract ： Objective Fo o b sen e the effects of different concentrations of Naingin ( N G ) on interleukin - 1 P ( II.-
i p) — induced inflammatoi 7 response in rabbit articular chondrocytes and explore the potential of N G in the treatment of osteoarthritis. Methods Rahhit arti('ular chondrocytes cultured in vitro were induced hy inflammatorv induction with IL - ip, and a chondrogenic arthritis cell model was estal)lished. T h e chondrocytes were identified by fluorescence inverted microscope and acridine orange and toluidine blue staining, and the N G concentration was screened by C C K -8 cell viability. T h e second generation well — growth chondrocytes were obtained, and the experiment was divided according to the culture. There were 5 groups ： blank group( C ) , model group( M ) , observation group( 0,, , 0M , 0, ) , continuous intervention for 72 li, and IL — 1 p was added 24 h before R N A and protein extraction. T h e expressions of proteoglycan( aggre- can) , type I I collagen( C o L - I I ) , matrix metalloproteinase - 13 ( M M P - 13) and S 0X 9 were detected by q K T - P C R and Western blot.
Results
I'he results of acridine orange and toluidine blue staining were positive, and the chondrocytes
were isolated and cultured in vitro. C C K -8 showed that w h e n the N G concentration was greater than 10 "5m o l/L and less than 10 4mol/L, the cell viability was weaker than that of the blank group( P < 0. 05 ) , and the N G concentration was between 10 ~6m o l /L and 10 sinol/L. T h e cell activity was enhanced ( P <0. 05 , P <0. 01 ). T h e q R F - P C R showed that 基金项目：国家自然科学基金（8丨472103)；武汉市卫生计生委科研基金（W X 18M 01)；武汉市科技局应用苺础前沿项目（2019〇2070101 )
作者简介：胡静（1991 -)，男，贵州遵义人，硕士研究生，研究方向：运动损伤.
通讯作者：李章华（1973-)，男，湖北武汉人，教授、主任医师，博丨：研究生导师，博丨:，研究方向：股骨头坏死的机制研究。E-mail:
189****0121@q q. com
中
华中医药
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学刊
第38卷第12期2020年12月
中华中医药学刊
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V〇1.38 No. 12
Dec. 2 0 2 0
c o m p a r e
d with th
e b l a n k g r o u p,the expression levels o桂花新品种
f C o L- I I ,A
g g r e c a n a n d S O X9 in the m o d e l g r o u p w e r e significantly d e c r e a s e d(F<0. 05 ,P< 0.01 ),a n d the e x p r ession of M M P - 13 w a s incr e a s e d(P< 0.05 ).C o m p a r e d wit
h those of the m o d e l g r o u p,T h e colli,S0X9 a n d A g g r e c a n w e r e significantly
i n c r e a s e d(P<0. 05 ,P<0. 01 ),a n d the e xpression of M M P- 13 w a s significantly d e c r e a s e d(P<0. 05, P<0. 01 ).W e s t e r n blot s h o w e d that c o m p a r e d wit h those of the n o r n m l g r o u p,the expression levels of rolll,S O X9 a n d A g g r e c a n in the m o d e l g r o u p w e r e significantly d e c r e a s e d (P<0. 05 ,/J<0. 01 ) ,a n d the expression of M M P- 13 w a s increased(P< 0.05 ).C o m p a r e d with those of the m o d e l g r o u p,the expression levels of colli,S O X9 a n d A g g r e c a n incr e a s e d at different concentrations a n d M M F- 13 d e c r e a s e d. T h e r e w a s a concentration—d e p e n d e n t tr e n d.C onclusion N a i n g i n c a n regulate the c h o n d r o c y t e matrix a n d i n f l a m m a t o r y m i c r o e n v i r o n m e n t,p r o m o t e the expressions of C o L - D，S O X9 a n d A g g r e c a n in c h o n d r o c y t e s a n d inhibit M M P - 13, thereby reversing the i n f l a m m a t o r y degeneration of c h o n d r o c y t e s induc e d b y I L- 1p.
Keywords ：naringin；osteoarthritis；interleukin—1 P;c h o n d r o c y t e s
骨关节炎（osteoarthritis，O A)是世界上最常见的关节疾 病，60岁以上人中大约有10%的男性和18%的女性遭 受0A的困扰因关节退化引起的关节软骨退行性变和继发性骨质增生表现为关节疼痛、僵硬、肿胀、活动受限甚 至畸形等，预计到2020年，O A将成为全球第4位的致残因 素&。其常规包括用非留体抗炎药来控制疼痛和终末期的关节成形术等，都不能很好的控制该病的症状和进 展5]。
关节软骨细胞在软骨形成和代谢修复中起着重要作用，继发的软骨退变是骨性关节炎最重要的病理变化:4]。I L- 1(3对软骨细胞表型、细胞基质和炎性微环境的 调节十分重要，可加剧细胞外基质降解和分泌更多的促炎因 子和炎症介质，进一步干扰细胞的功能，加快0A的进展5。
骨碎补，又名石岩鸡、山知母等，主产于广西、云南等 地。传统医学认为，骨碎补主治肾虚腰痛，耳鸣耳聋，跌打 闪挫、筋骨折伤等，广泛用于骨折、骨质疏松等骨相关疾病 的。抽皮苷（N G)是骨碎补的主成分提取物（图1)，属于二氢黄酮类化合物，分子量为580.55。现代药理学研究表明，N G具有多种生物活性：抗炎、抗氧化、促进成 骨细胞增殖，软骨细胞表型维持及炎性微环境调节等8。本研究通过I L- I p刺激软骨细胞，构建0A炎性退变细胞 模型，观察不同浓度的N G对软骨细胞炎性微环境的影响，为其防治0A提供参考和理论依据。
OH
图1抽皮苷单体化学结构式
1材料与方法
1.1主要材料与试剂
柚皮苷，来源于中药骨碎补提取物，纯度>98%，货号 M B2189-S，购自 sigmal公司；胎牛血清（fet
al bovine serum, FBS)来自美国Gibco公司；重组大鼠II. -1(3购自美国Pe P-r(>Tech公司，货号六[-200 - 011?；双抗溶液（青霉素/链霉 素）、防荧光淬灭剂购自武汉博土德公司；DEME/F-12基 础培养基购自美国H y c i o n e公司；CCK- 8试剂盒购自日本 同仁化学研究所；吖啶橙、甲苯胺蓝细胞染液均购自上海 碧云天公司；二甲基亚砜（DMS0)、0. 25%胰蛋白酶购自美 国s i g m a公司；EZNA总RNA提取试剂盒购自美国OMEGA 公司；qPCR逆转录试剂盒、qPCR试剂盒购自日本T0Y0B0 公司；CoL- n、S0X9、ACAN和MMP- 13抗体均来自武汉三鹰公司。
1.2主要仪器与设备
C02培养箱（T h e r m o S c i e n(、f公司，美国）；炎光倒置相
差显微镜（L E I C A公司，德国）；低温高速离心机D3024
(S C I L0G E X公司，美国）；超净工作台V C M -620(再鑫仪
器有限公司，中国）；E L X800酶标仪（B i o - T e k公司，美 国）；实时荧光定量P C K仪（B k>- R a d公司，美国）；37度水
浴锅（精宏公司，中国）；超低温冰箱（S a n y o，日本）；电泳仪
及转膜仪化丨〇-1^0，美国）。
1.3 方法
1.3. 1软骨细胞的分离、培养和传代参照软骨细胞分离
培养步骤9：新西兰大白兔(3周龄，湖北省实验动物中心，
合格证号:S Y X K鄂2014 -0080)颈椎脱曰处死后于75%酒
精中浸泡15 m i n，剪下四肢，剔除皮肤、肌肉，暴露关节软
骨。切下透明软骨并于装有无菌P B S的培养皿中将其剪
成1m m X 1m m X 1m m大小的块状，P B S漂洗3遍。将小
块组织移人15 m L离心管中，加人0. 2%的二型胶原酶消
化过夜。以1500 r/m i n离心5 m i n，弃上清，反复3次。吹
打混匀后转入25 c m2细胞培养瓶中，加入D M E M -F12完
全培养基，于5%C02,20%02,37 t培养箱中培养3 d后换
液，待细胞融合度达到80% ~ 90%后进行传代。当第2代
软骨细胞融合度达到80%时，弃上清，加人1m L的0. 25%
胰蛋白酶漂洗两遍，每瓶滴人7〜8滴胰蛋白酶于37 t消
化至细胞脱落，加人10 m L D M E M - H2完全培养基吹打
混匀后分装人25 c m2细胞培养瓶中，放人5%C02,20%
02,37 t培养箱中常规培养传代，倒置相差显微镜下定期
课堂内外高中版观察。
1.3.2实验分组取第2代生长良好的兔关节软骨细胞，
根据所加培养物不同将实验分为5组：空白组（C，加人等
体积的P B S)；模型组M( 10 n g/m L[L - i p)；观察组0H
(10_6N G + 10 n g/r a L I L - 1(3) ,0M ( 10'7N G + 10 n g/m L
IL- i p)、0L(l(r8I V G+ 10 n g/m L I L- 1(3)，连续干预 72 h，
于R N A和蛋白提取前24 h加人I L-1(3。
1.3.3甲苯胺蓝、吖啶橙染鉴定软骨细胞取第1代软
骨细胞，胰酶消化后以2 x104个细胞密度接种到铺有多聚
赖氨酸盖玻片的6孔板中，置于培养箱中常规培养细胞爬
片24 h取出制备好的细胞爬片，95%乙醇固定15 m i n，然
后P B S漂洗3次，1%的甲苯胺蓝染液染30 m i n,P B S漂
洗3次，自然干燥后用中性树胶封片，倒置荧光显微镜下观
察并拍照同样取第1代软骨细胞进行细胞爬片,95%乙
醇固定10 m i n，干燥后加人足M0.01%吖啶橙染液染5
m i n,P B S漂洗 1m i n,0. 1m o l/L 氯化钙分 1m i n,P B S 漂
vx545hd洗3次，每次数秒，加人防荧光淬灭剂，荧光显微镜下观察
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学
刊
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中华 中医 药学刊
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并拍照。
1.3.4 CCK -8法检测细胞活性运用CCK -8试剂盒测 定不同浓度NG 对软骨细胞增殖效果。取第1代（P 1)软骨 细胞，以4x l 03个（孔）接种于96孔板。设置空白对照组 (10%的FBS 、2%的青-链霉素、88%的I_)M E M - F 12培养 基，不添加额外生长因子）；不同浓度NG 组（常规培养的基 础上加人不同浓度的NG ，使其终浓度分别为1 x 10 ~ 1 x 10_9 mol/L )，每组4个复孔。细胞贴壁6 h 后更换新的培 养液并弃去未贴壁细胞，继续培养12 h 后每孔加人10 +L CCK -8溶液，轻轻振荡混匀后常规培养2 h 用酶标仪检测 在450 nm 波长处的光密度值，确定NG 对细胞的增殖情况。 1.3.5荧光定量聚合酶链式反应用Trizol 收集各组软 骨细胞，抽取总RNA ，并用Nan » i )r 〇P蛋白核酸定量仪检测 RNA 浓度。用T 0Y 0B 0公司的逆转录试剂盒把提取的 RNA 逆转录为cDNA ，构建荧光定量聚合酶链
式反应 (qRT -PCR 〉20 p L 体系(10 (jl L S Y B R M i x t u r e ，上下游弓|物 混合物和c D N A 样本各I pX ，加D E P C 水至20 pL )。反应 条件如下:95 t 预变性1 m i n ,95 t 变性15 s ,72 T 退火15 s ,60丈延伸15 S,39个循环后检测溶解曲线，每组设3个 复孔，以GAPDH 为内参。各组CT 值按公式2_AiCT计算相 关指标的相对表达量。实验引物序列详见表1。
表1目的基因和内参基因的引物序列名称
上游引物(F )
下游引物(R )
c 〇L -n CM GAACAGCATTGCCTATCTG GATAACAGTCTTGCCCCACTTA A ggrecan CAACAACGCTCAGGACTACCAGTG GCCAGATCATCACCACGCAGTC S 0X 9
TCAACGGCTCCAGCAAGAAC
CTCCGCCTCCTCCACGAAGG M M P -13CTTCCTGATGATGACGTrCAAG GTCACA CTTCTCTG G TG nT GAPDH
TGGAATCCACTGGCGTCTTC
G GTTCACGCCCATCACM AC
1.3.6蛋白免疫印迹法胰酶消化收集各组软骨细胞，加
人RIPA 裂解液于冰上裂解30 m i n ，然后以4 I C 、12()00 r / mill 离心15 m i n 取上清液5 j j X 进行蛋白定量，将离心后 的蛋白样品按1 :4的比例加人5 x 的SDS 蛋白上样缓冲液 混匀，最后在1〇〇 t 金属浴加热5 m i n 使蛋白充分变性，储 存于-20 t 保存待测。电泳、转膜和显影，蛋白样品经 10%分离胶和5%浓缩胶凝胶电泳后，根据预染蛋白Mark
er 位置切取 目的条带和内参条带，再将蛋白于预冷的转膜 液里转至PVDF 膜(250 mA ，60 min ),PVDF 膜经5%脱脂奶 粉封闭1〜2 h 后，孵育一抗过夜，次日孵育二抗，洗膜30 m i n 后按1 : 1比例配制E C L 显影液滴加到膜上于b i o - RAD 凝胶成像系统拍摄扫描图片，lnulge J 软件分析条带灰度值。 1.3.7统计学方法用SPSS 23.0统计软件，所有数据均
采用；表示，两组样本间的均数比较采用独立样本的* 检验，多组样本间采用单因素方差分析,P <0.05表示有统 计学差异。2结果与分析
2.1软骨细胞形态学观察
在荧光倒置显微镜下可见：分离培养的原代细胞12 h 后开始贴壁，24 h 开始铺伸，细胞体积较小（插
页V 图 2A )，3 d 后细胞数量明显增多，呈三角形或多边形（插页V 图2B )，5 (1后细胞融合成片，如“铺路石”状（插页V 图 2C )。5 d 左右细胞即可传代种板，加药干预。传代后细胞 生长速度加快，细胞周围可见具有折射光的细胞基质（插 页V 图2D )。
2.2软骨细胞鉴定
软骨细胞的表型特征性产物c 〇l - n 与甲苯胺蓝碱性
染液结合后呈异染性。本实验中，甲苯胺蓝染显示：软骨
细胞单层生长，呈三角形或多边形，细胞质染为蓝紫（插 页V 图3 A )。吖啶橙荧光染显示软骨细胞核呈清晰绿 荧光（插页V 图3B )。2.3软骨细胞炎性模型构建
软骨细胞用不同浓度的比-丨p (0 ~40 ng /mL )作用48 h ，软骨标志物CoL -丨丨的表达水平通过IV T - qPCK 和W B 检测。与对照组相比，CoL -丨丨从开始到3 h 略有升高，之 后逐步下降，到24 h 降低最明显（/><0. 05)，插页VI 图4A ; 10 ng /mL 的丨L -丨p 处理24 h 后CoL - II 的表达量显著降低 (P <0. 01)，插页VI 图4B。IL - 1(3的时间和浓度跟Tomohiro 等111人的结果吻合。
2.4 NG 对软骨细胞增殖活性的影响
取P 2代软骨细胞，待其铺满至70% ~ 80%时，用稀释 好的不同浓度NG 干预软骨细胞24 h ，检测NG 对细胞增殖 活性的影响，筛选出NG 的最佳剂量范围，如插页VI 图5所 示。结果表明：与空白组（不加人NG )相比，10_4、10_5、 HT 9 mol /L 浓度下软骨细胞增殖活力下降（f <0.05); NG 浓度在l (T 6、l 〇-7、l 〇_8m ol /L 时，软骨细胞的增殖活力较 空白组增加（Z 5 <〇.〇5 ,P <〇.〇1)。
2.5不同浓度NG 对I L -i p 诱导软骨细胞mRNA 的影响
经10 ng /rnL 白介素处理24 h 后，(：虬-I I 、S 0X 9和 Aggrecan 的表达量均显著降低（P < 0. 05 , P < 0. 01 ), 1^-13表达量显著升高（尸<0.05)；经1\10(10-6、1〇-7、 l (T sm 〇l /L )处理后，软骨细胞中CoL - U 、S 0X 9和Aggre - can 的表达量明显高于模型组（P <0.05,P <0.01)，MMP - 13表达量明显低于模型组（P < 0.05, P < 0.01), NG 有效 诘抗了 IL -i p 诱发合成因子活性的降低，且随着NG 浓度 增加，其拮抗效果呈浓度依赖关系。如插页VI 图6所示。 2.6不同浓度NG 对I L -l p 诱导软骨细胞蛋白的影响
经10 ng /m L 白介素处理24 h 后，与正常组相比，模型 组CoL - I I 、S 0X 9和Aggrecan 的表达■均显著降低（户<0.05，P <0. 01),MMP - 13 表达量显著升高（尸<0. 05)。 与模型组相比，NG 不同浓度的CoL - I I 、S 0X 9和Aggrecan 表达量均有上升；MMP -13下降，且有浓度依赖趋势。如 图7、插页\1图8。
C O L D
m m p -13
g a p d h
m m m m m m rn
c
M
°L
图7各组N
G
对I L -i p 诱导软骨细胞干预的蛋白表达
3
讨论
骨性关节炎发病率呈逐年递增趋势，预计到2020年，
将成为全球第4位的致残因素，给家庭和社会带来沉重负 担12]。0A 形成与发展过程中关节软骨的退变起决定性作 用，其防治的重点是如何延缓软骨退变"：软骨细胞和胞 外基质构成关节软骨，生理条件下，成人软骨细胞占软骨总 体积的2%，此外由胶原（II 型胶原占80% ~90%)、蛋白聚 糖等组成13。n 型胶原和蛋白聚糖均属软骨细胞分泌的 特异性产物，是评价软骨细胞增殖和表型的重要指标14 =
中
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MMP- 13在n型胶原和蛋白聚糖等软骨基质合体的裂解 中起重要作用，是关节软骨中最具活性的胶原蛋白裂解酶 之一n5~161。S0X9是软骨向诱导因子诱导成软骨分化过程 中的“分子开关”和“关键节点”，S0X9过表达能抑制软骨 细胞的肥大，延缓终末分化及骨化过程并结合ColX基因启 动子激活该基因的表达，负向调节软骨细胞肥大进程17'。众多研究表明，NG具有促进间充质干细胞、软骨细胞和成 骨细胞增殖的生物学活性，然而，其作用途径和NG的时间浓度依赖关系尚未完全可知：
NG是中药骨碎补的主要有效成分，临床上应用包括 骨碎补在内的补肾强骨药物骨关节炎取得一定效果19:。LUO YL等〜研究发现，在慢性支气管炎脉鼠模型 中，高浓度NG(36. 8 m g/kg)在减少上皮组织化生、肺泡壁 增厚等炎性控制上优于强的松。很多学者认为，NG发挥 抗炎作用是通过抑制NF - K B表达来实现的，通过对TNF-o/IFN -飞诱导的炎症趋化因子RANTES表达进行 观察，发现在NG作用下，炎症趋化因子RANTES表达分别 下降了 15%和16%。较高浓度的NG(1 mm ol/L)能有效降 低细胞核因子NF-K B-P65蛋白在细胞核中的表达，发挥 了抑制炎症反应的作用，并推断此通路可能是抑制RANTES 表达降低的一种方式％。KAW AGUCHI K等夂对NG干预胶 原诱导型关节炎模型C1A小鼠进行观察，发现高浓度组N G (150 m g/kg)给药后40 (I炎症指标经PCR检测呈下降趋势。该研究表明,NG对风湿性关节炎具有抑制作用，但在退行性、自身免疫性骨关节炎的报道较少，值得进一步深究。
本研究在前期结果的基础上对终浓度为I x 1(T4 mol/L~ 1x 10 mol/L的NG干预软骨细胞进行初筛，同时对白介素-1(3作用于软骨细胞的浓度和时间进行重复。最终确定白介素-1P在浓度为10 ng/mL条件下作用于软 骨细胞24 h达到炎性峰值，同时CCK-8显示NG浓度在 1x l(T6m〇l/L~l x l0_8m ol/L不影B向细胞活性。结果显 示,1x l0_6m〇l/L~l x l0_8nl〇I/L均可以促进软骨细胞增 殖，且呈浓度依赖趋势。NG作用软骨细胞72h后CoL-II、aggrecan、S0X9 mRNA水平较对照组均有升高（P> 0.05或 P>〇.〇1)，说明该浓度可以促进软骨细胞增殖和表型维持；同时MMP-13表达较对照组下降（P>0.05或P>0.01), NG对1L- I p剌激软骨细胞引起的炎性环境具有抑制作用。
综上所述，NG具有调节胞外基质，拮抗由白介素-1p 引起的软骨细胞炎性退变。然而，NG发挥作用的具体途 径和相关靶点还有待进一步探索，临床应用于病人还需对 其提纯方法、稳定性等进行深人研究。
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中
华
中
医
药
1
41
一
学
刊
远程浏览器隔离第38卷第12期2020年12月
中华中医药学刊
C H I N E S E A R C H I V E S O F T R A
D I T I O N A L C H I N
E S E M E D I C I N E
V〇1.38 No. 12
Dec. 2 0 2 0
柚皮苷对白介素-1(3诱导的兔关节软骨细胞炎性反应的调节作用
(正文见38-4丨页）
A原代细胞l d(10x:B原代细胞3d(10>〇
C原代细胞5d(10x1D具有折射光的P1软骨细胞（20 )
图2荧光倒置相差显微镜下观察软骨细胞形态
A甲苯胺蓝染软骨细胞B吖啶橙染鉴定软骨细胞图3荧光倒置显微镜下软骨细胞鉴定观察(20 x
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