张长发; 罗世明银联商务有限公司江苏分公司
【期刊名称】《《青岛农业大学学报（自然科学版）》》指路器
【年(卷),期】2019(036)004
【总页数】8页(P267-274)
【关键词】线粒体; MT-ND3; 线粒体疾病; 异位表达 【作 者】张长发; 罗世明
【作者单位】青岛农业大学动物科技学院 山东青岛266109
【正文语种】中 文
【中图分类】Q786
线粒体复合体Ⅰ(NADH泛醌氧化还原酶)是细胞内最大的膜结合酶之一，其大部分嵌入于线粒体内膜中，部分突出于线粒体基质之中，通过利用NADH的还原电位来驱动质子穿过线粒体内膜，从而为哺乳动物线粒体中ATP的合成提供动力[1]。复合体Ⅰ(Complex I, CⅠ)也是线粒体呼吸链(mitochondrial respiratory chain, MRC)中最大的一个多蛋白酶复合物[2]，其至少含有45个多肽，其中有7个亚基(MT-ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6、ND4L)是由线粒体基因组所编码，并且均是CⅠ催化“核心”的一部分，而其余的至少38个亚基则由核基因组所编码，在CⅠ的组装、催化、稳定与调控中起到重要作用[3]。因此相应的线粒体 DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)或核DNA(Nuclear DNA, nDNA)的突变则会造成CⅠ功能的缺失，导致线粒体呼吸链紊乱，最终引发线粒体疾病。
线粒体疾病是由于编码呼吸链复合体蛋白的mtDNA或nDNA的缺陷引起的多样化的遗传性疾病[4]。其中CⅠ缺陷最为常见，而且高达30%儿童的线粒体疾病是由CⅠ缺陷而引起的。CⅠ缺陷引发的疾病在临床上可能存在各种症状与体征，从孤立性的肌病或肝病到致命性的多系统疾病[5]。MT-ND3突变越来越被认为是造成CⅠ缺陷最常见的原因，其中MT-ND3的m.10191T>C突变可以导致Leigh综合征(Leigh syndrome，LS)，并伴有广泛的临床表现[6]。而且MT-ND3突变(m. 10197G>A)也可以造成LS与肌张力障碍[7]，m.10158T>C(MT-
ND3)突变则可以导致MELAS综合征(Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)，同时还出现了持续癫痫的症状[8]。人的MT-ND3的10398位核苷酸位点具有高度的多态性，m.10398A>G可能造成CⅠ效率降低，而且在阿尔茨海默病(Alzheimer’s)和帕金森病(Parkinson’s disease)等神经退行性疾病中存在m.10398A>G多态性,该突变也作为乳腺癌的风险因素而被研究[9]。 MT-ND3突变也会导致严重的婴儿线粒体脑病，甚至会造成婴儿死亡。随着人们对线粒体疾病的不断重视与研究，越来越多新的MT-ND3突变被发现，而对相应mtDNA突变引发的疾病病因与发病机制也有了更深入的理解。
尽管随着科学技术的进步获得基因诊断的能力正不断的提高，但是能够有效线粒体疾病的方法却没有[10]。目前，针对线粒体疾病的主要是利用药物缓解相关症状，而无法真正治愈[11]。考虑到线粒体疾病本质上是由于mtDNA突变所引起的，因此，基因被认为是线粒体疾病的有效途径。其中利用核基因来异位表达(Allotopic expression)mtDNA编码的蛋白就是基因策略之一，该策略是在细胞核中表达野生型的mtDNA蛋白编码基因，新合成的蛋白在信号肽的引导下进入线粒体中，将突变的蛋白进行替换[12]。已经有研究表明，在患有Leber遗传性视神经病变的大鼠模型中，眼部注射含有 网关设备人类ND4基因的重组腺相关病毒载体后，其视网膜神经节细胞变性得到了明显的预防[13]，这无疑为利用异位表达策略来线粒体疾病提供了可能。目前，只有仅限的几种mtDNA疾病通过利用异位表达策略来进行研究，其中研究最多的是通过该策略对Leber遗传性视神经病变(MT-ND4突变)的，而利用此策略对MT-ND3基因突变引起的线粒体疾病的研究还未有报道。因此，本研究在哺乳动物细胞中初步探讨了异位表达MT-ND3基因的可能性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
Hela细胞(Sangon)、DMEM/F12(1:1)基础培养基(HyClone)、胎牛血清(PAN)、青链霉素(Sangon)、PBS (Sangon)、质粒mEmerald-Mito-7(Addgene)、质粒mCherry-Vimentin-N-18(Addgene)、质粒mEGFP- ER-5a(Addgene)、EcoRV(NEB)、BglII(NEB)、NheI(NEB)、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent(Invitrogen)、2 × Phanta Max Master Mix (Vazyme)、ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme)、LB Agar Powder, Miller (Sangon)、Total RNA Extractor (Sangon)、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (
Vazyme)、Rhodamine 123 (碧云天)、G418 sulfate (Sangon)、Trypsin-EDTA Solution (Sangon)、活性氧检测试剂盒(碧云天)、Hoechst 33342(碧云天)、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (TransGen)、Agarose (TransGen)、50X TAE Buffer (Sangon)、SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒(Sangon)、SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒(Sangon)、SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒(Sangon)等。
1.2 试验方法
1.2.1 细胞培养
用含10%胎牛血清与1%的青链霉素的DMEM/F12培养基于37 ℃培养箱(含5% CO2)正常培养Hela细胞，当细胞密度在90%左右时进行细胞传代，首先用1X PBS洗一遍细胞，用胰酶消化液对Hela细胞进行消化2～3 min，去除胰酶消化液并用含血清的培养基轻轻吹打培养皿底，使Hela细胞从皿底部脱落下来，于离心机1 200 r/min离心3 min，去除上清并用培养液重悬细胞沉淀，按60%密度接种细胞并培养。
1.2.2 质粒构建
以和为贵13
质粒pla-mCherry的构建：以质粒mEmerald-Mito-7(Addgene, #54160)为模板进行PCR(F1，R1)，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并将目的条带 (4 821 bp) 进行切胶回收。以mCherry-Vimentin-N-18(Addgene, #55158)为模板进行PCR扩增(F2，R2)，将红荧光蛋白(mCherry)序列扩增出来，将PCR产物进行切胶回收。用重组试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将上述两种纯化的PCR产物进行重组，将重组产物用DH5α感受态细胞进行转化，并用含有卡那霉素的LB固体培养基进行平板接种，在37 ℃生化培养箱中培养12～16 h，最后挑菌测序鉴定。 质粒pla-R1-mCherry的构建：基因片段Rg9mtd1 (105 bp) 在生工生物公司合成，并用引物(F3，R3)对Rg9mtd1核酸序列PCR扩增，将PCR产物进行产物纯化。用NheI与BglII对质粒pla-mCherry进行双酶切，并对酶切产物进行胶回收。用重组试剂盒将上述产物进行重组，后续步骤同上。
质粒pla-R1-ND3与pla-ND3-mCherry的构建：用EcoRV对质粒pla-R1-mCherry进行单酶切并纯化。用通用密码子优化过的MT-ND3(348 bp)核酸序列在生工生物公司合成，并用引物(F4，R4)对MT-ND3核酸序列进行PCR扩增与纯化，将酶切载体(pla-R1-mCherry)与MT-N
自然基金
D3基因片段重组获得质粒pla-R1-ND3。用BglII对质粒pla-mCherry进行酶切并纯化，用引物(F5，R5)对MT-ND3核酸序列进行PCR扩增与纯化，将酶切载体(pla-mCherry)与MT-ND3基因片段进行重组获得质粒pla-ND3-mCherry。
表1 PCR的引物序列Table 1 Designed primer sequences used for PCR引物名称Primer引物序列 (5′-3′)Primer sequences (5′-3′)F1GCGGCCGCGACTCTAGATCR1GCTAGCGGATCTGACGGTTCF2ACCGTCAGATCCGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGR2GGTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCCCGGGCCCGCGGTACCTTAGATATCAAATT CTTTGCTTTCCT-TG TACAGCTCGTCCATGF3GTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAACGTGACCGTGAGGTTCR3GCCTCCGCCACCAGATCTGTACCTCTGCAGCACGCCF4AGCGAAAGCAAAGAATTTATGAACCTGTACACCGTGR4CCCGGGCCCGCGGTACCTTACTCGGTCCACTCCAGGCCCF5GGCGTGCTGCAGAGGTACAGAAACCTGTACACCGTGATCTTCR5CGAGCCTCCGCCACCAGACTCGGTCCACTCCAGGCCC
1.2.3 稳转细胞系筛选
利用转染试剂Lipofectamine 3000 Transfection Reagent将质粒pla-R1-ND3转入Hela细胞内，转染24 h后将细胞培养液更换成含有G418的细胞培养液(不含青链霉素)并及时更换液培养，培养约12 d左右(当在荧光显微镜下观察到大部分细胞死亡，绝大多数存活的细胞都含红荧光时)，再将培养液更换至正常培养液继续培养，当含有红荧光的细胞形成足够大的细胞克隆时，挑取细胞克隆吹散培养。用上述方法本实验共筛选了两株稳转细胞系(R
1-ND3与Mito-GFP)，其中R1-ND3细胞系自带红荧光。Mito-GFP细胞系是用质粒mEmerald-Mito-7转染Hela细胞而筛选出来的自带绿荧光的稳转细胞系，并且绿荧光能够定位于线粒体上。
1.2.4 线粒体膜电位、ROS水平及细胞增殖情况的测定
将稳转细胞系R1-ND3细胞与正常Hela细胞等比例混合，将细胞混合液按20%～30%的细胞密度传于8孔腔室盖玻片中，在37 ℃培养箱(含5%的CO2)中培养，直至有克隆细胞团长出。用染料Rhodamine 123与活性氧检测试剂盒分别对各腔室中的混合细胞克隆团进行孵育，最后用共聚焦显微镜进行活细胞观察，检测R1-ND3细胞与正常Hela细胞的线粒体膜电位与ROS水平。用染料Hoechst 33342对8孔腔室中的混合细胞克隆团进行孵育，在荧光显微镜下进行观察，根据R1-ND3细胞与正常Hela细胞的单细胞克隆团中的细胞核数目对克隆细胞团进行计数，最后用SPSS统计软件对数据进行统计分析。
信息采集1.2.5 荧光定量PCR(qPCR)
细胞样品的总RNA用Trizol法(Total RNA Extractor)来进行提取，并用反转录试剂盒(TransS
cript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)来进行第一链cDNA的合成，随后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 来进行qPCR检测各目的基因(MT-ND5, MT-ATP6, MT-CO1, MT-CYB, ACTB)的相对表达情况。其中各组实验进行3次重复，用比较CT法来进行目的基因的相对定量分析，最后用SPSS统计软件对数据进行统计分析。
表2 qPCR的引物序列Table 2 Primers used for qPCR引物名称Primer引物序列 (5′-3′)Primer sequences (5′-3′)产物长度/bpProduct size /bpMT-ND5-FCGGAAGCCTATTCGCAGGAT236MT-ND5-RGGATTGTGCGGTGTGTGATGMT-ATP6-FACCACAAGGCACACCTACAC157MT-ATP6-RTATTGCTAGGGTGGCGCTTCMT-CO1-FATACCAAACGCCCCTCTTCG116MT-CO1-RTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTMT-CYB-FCCCACCCCATCCAACATCTC116MT-CYB-RGAGGCGTCTGGTGAGTAGTGACTB-FCATGTACGTTGCTATCCAGGC250ACTB-RCTCCTTAATGTCACGCACGAT
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议